Adv。Mater。细胞外基质加强互锁支架抗剪切抗压缩促成骨

　　几十年来，工程师和科学家向大自然寻求设计灵感，导致了生物仿生学和仿生工程的诞生。为了促进具有机械互锁界面的模块化组织工程， 互锁支架应具有生物相容性，保持高孔隙率以促进细胞和营养物质的迁移，并应保护细胞免受所模拟的解剖结构的机械应力 ，与ECM和细胞协同工作的联锁支架可以改善模块化组织工程的结果。在此， 内布拉斯加大学林肯分校的Jingwei Xie教授组 报告了一种 新型的的互锁和细胞外基质强化生物材料 ，它能 承受生物条件下的剪切和压缩负荷，并能提高细胞生存率（图1） 。相关文章  ＂Extracellular Matrix Secretion Mechanically Reinforces Interlocking Interfaces＂于2022年11月29日发表在杂志《ADVANCED MATERIALS》上。
　　图1材料的制备和表征
　　尼龙-6，6被选为模型聚合物，因为它的性质与聚乳酸相似，易于生产，而且由于本研究需要大量纤维，因此成本较低。该团队试图优化纤维的长径比以获得最佳的抗压和抗剪切性能，直径为10：1，以获得 最佳的绒毛排列 。在确定了每种支架类型的结构特征后，以固定速率进行了抗压和抗剪切实验。剪切阻力是使用改进的拉伸实验测量的(图2a)，纤维可以在横向负载的情况下互锁并抵抗剪切力，测试了横向负载的三种情况：无负载、小负载(~5N)和大负载(~20N)(图2b)，发现 较高的横向载荷可以促进更深程度的纤维渗透，并提高支架的抗剪切强度 。支架对横向负荷的程度有不同的反应，如长而厚的纤维在无负荷下有较高的临界力，而短而薄的纤维在较高的横向负荷下有较高的临界力（图2 c-e）。压缩实验包括以恒定的速率平行于互锁的支架施加压缩载荷，持续4个周期（图2 f），抗压能力随着纤维直径的减少而减少，图2g中给出了最大抗压负荷的统计结果图。加权T-Score显示O型支架(1.5dTex，30μm纤维长度)是最理想的，因此，聚乳酸(PLA)因其机械强度、生物相容性和易植入性而被选为理想的聚合物。最后，为了确保细胞活性，将MC3T3-E1细胞接种在聚乳酸支架上，在第1、3、5和7天测量细胞活力， 显示细胞增殖显著增加 ， 第7天胶原染色显示细胞附近有少量胶原沉积 。
　　图2. 支架的抗剪、抗压性能
　　细胞存活率评估
　　在机械压缩细胞的过程中会诱发多种细胞死亡，因此，应力屏蔽是一种理想的支架特性，作者提出了一种纤维弯曲机制，它可能对粘附在纤维上的细胞产生小的局部变形，但能减轻大的全细胞压缩（图3 a）。首先使用细胞活力测定法评估细胞毒性。结果发现，用3D打印的压缩嵌件直接培养MC3T3-E1细胞后，存活率没有明显增加，但在24和48小时后仍保持90%以上的存活率（图3 b）。用吸光度表示静态培养条件下的细胞的正常化，我们注意到在1.1千帕的压缩负荷下，存活率首次明显下降，在2.8和5.5千帕下，存活率急剧上升（图3 c）。24小时后，发现 互锁支架比电纺纳米纤维膜有更明显的保护作用 （图3 d）。综上所述， 互锁支架显示了在机械压缩过程中保护细胞的能力，这主要是由于支架有能力抵御纤维弯曲带来的压缩 。
　　体外ECM的沉积促进细胞成骨分化
　　作者假设，随着播种细胞及其分泌的ECM的增殖，支架也会经历机械强度的增加。为了研究这一点，首先必须确定ECM成分的沉积。将MC3T3-E1细胞的长期培养40天。COL1A和DAPI的共聚焦成像显示，I型胶原蛋白的分泌在第10天时不多，在第20、30和40天之间明显增加（图4 a）。在第0天、第10天、第20天、第30天和第40天对各种成骨基因进行了分析，以证实在用互锁支架培养期间可以发生成骨分化。为此，用PCR分析了BMP7、RANKL、BSP、ALP、OCN、OPG、RUNX2和Col1A（图4 b），发现除OPG外，每个被检测的基因都 随着培养时间的推移而明显增加 。 成骨标志物的变化进一步表明，三维环境能够刺激成骨分化 。
　　图4. 胶原蛋白增强的互锁支架的细胞活力及成骨分化
　　互锁支架与外源或内源细胞和ECM协同发挥作用
　　最后，为了说明互锁支架如何与外源或内源细胞和ECM协同发挥作用，在培养10、20、30和40天后，测量了MC3T3-E1细胞播种的互锁支架的压缩和剪切阻力曲线（图5 a和b）。通过测量羟脯氨酸，在第10、20、30和40天对胶原蛋白（COL1A）进行了量化，发现从第10天的支架大约为60克，到第40天支架增加到的大约250克（图5 c）。并通过线性回归证实，从基线到第40天，压缩阻力大约增加了4倍，并与胶原蛋白含量的增加高度相关（图5 a，c和d）。同样通过线性回归证实，剪切阻力从基线到第40天大约增加了10倍，并与胶原蛋白含量的增加密切相关（图5 b & e）。图5 f和g中指出了与基线的百分比变化。
　　图5. MC3T3-E1细胞种植的互锁支架在培养10、20、30和40天后的应力曲线
　　综上所述，一种新型的 互锁支架的生物力学基础是有必要的 ，该支架 在机械压缩过程中保护细胞，并通过与细胞及其ECM分泌的协同机制进行机械强化 。表明，在长期培养过程中， 互锁的界面能够维持MC3T3-E1细胞的生长，它们分泌的ECM能够机械地加固界面，并促进成骨分化 。这种互锁支架有可能用于模块化组织工程界面（如肌肉-骨、肌腱-骨、骨-软骨、真皮-表皮交界处）和结构性生物粘附。
　　文献来源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202207335
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