人参皂苷Rh2对LoVo细胞迁移和转移能力的影响及机制讨论

　　我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，联合化疗和生物治疗有助于提高患者的5 年生存率，然而，其药物本身的毒副作用极大限制了其应用范围。随着传统医学的复兴，越来越多的中药以及中药单体被应用于临床科学试验。人参皂苷Rh2 是人参中分离提纯的一种单体，其在各种肿瘤的相关研究中有着较为显著的作用，研究表明：Rh2 能有效抑制人肝癌细胞SMMC-7721、人结肠癌细胞Caco-2 和HT-29、小鼠宫颈癌细胞U14、人食管癌细胞Eca-109、马立克氏病肿瘤细胞系MSB-1、人白血病多药耐药(MDR)细胞K562/VCR的增殖，提高机体免疫力，引起肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤生长受到抑制。然而，针对人参皂苷Rh2 对结肠癌转移的实验研究，目前尚无研究报道。
　　目前，体外研究肿瘤细胞的转移能力主要采用Transwell 实验。Transwell 实验通过检测体外肿瘤细胞的迁移和侵袭能力来判断肿瘤细胞转移能力的高低。本研究拟采用Transwell 实验检测人参皂苷Rh2 对体外结肠癌LoVo 细胞的迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其分子机制，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1. 1 细胞和试剂
　　人结肠癌细胞LoVo 株由香港科技大学赠送;Rh2 购自上海雅吉生物科技有限公司(Cat No.A0241，纯度大于982.6 mg/g)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成10 mmol/L 母液分装冻存备用;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma 公司;胎牛血清、液体培养基RPMI-1640 和细胞培养用2.5 g/L 胰酶购自美国Gibco 公司;胶原预包被的Transwell (Cat No . 3422)购自美国Corning公司; 兔抗人 - Tubulin (BM1453)、-catenin(BA0426)、CD44(BA0321)、基质金属蛋白酶MMP2 (BA3716)、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP2(BA0576-2)和E-Cadherin(BA0475-2)抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
　　1. 2 主要仪器
　　Boxun SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台(中国上海博迅实业有限公司医疗设备厂);Thermo Fisher Scientific 细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技公司);Motic AE2000 倒置显微镜(中国麦克奥迪实业集团有限公司);IX71 荧光显微镜(日本Olympus 公司);iMark 680 酶标仪(美国Bio-Rad 公司);Bio-Rad 电泳转膜仪(美国Bio-Rad公司)等。
　　1. 3 MTT法测定
　　不同浓度Rh2对LoVo细胞增殖的影响5 103/孔LoVo 细胞接种于96 孔板内，完全培养基培养过夜，加入0、5、10、20、40、60mol/L Rh2 分别处理24、48、72 h，每个浓度做6 个平行孔，采用酶联免疫检测仪于490 nm 处测取每孔的吸光度(D)值。
　　1. 4 Rh2对LoVo
　　细胞迁移的影响将细胞密度为5 105 个/mL 的LoVo 细胞铺于24 孔板(每孔500L) 上，加入含体积分数10%胎牛血清的RMPI-1640 培养液，培养16 ~ 24 h，使形成单层细胞，换成无血清培养基继续培养过夜;用200 L 移液枪枪头在单层细胞上呈一字划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3 次;加入5、10、20、40、60mol/L 无血清培养基配制Rh2 溶液，平行2 个样本，孵育24 h，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。最后通过计数爬入一字划痕空白区域内的细胞数来反映细胞的迁移能力。
　　1. 5 Rh2对LoVo细胞转移的影响
　　待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS 和无血清培养基先后洗涤1 次;用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2 105 /mL，在24 孔板(下室)加入600 L 含体积分数15%血清的培养基;上室用70 L 无血清培养基培养箱孵育3 min，吸弃培养基后加入经过不同浓度的人参皂苷Rh2 处理的100L 细胞悬液;继续在孵箱培养24 h，用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800 L 甲醇的孔中;室温固定30 min，取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800 L Giemsa染液的孔中;室温染色30 min，轻轻用PBS 冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干;移至载玻片上，显微镜下随机取9 个大小一致的视野计数，统计结果。最后通过计数穿膜细胞数来反映细胞的转移能力。
　　1. 6 Western blot检测
　　CD44、MMP2、TIMP2、ECadherin和-catenin表达具体方法参见文献，对Rh2 处理后的细胞进行裂解提取蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转印。转印好的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜封闭后依次加入相应一抗和二抗，膜入发光液中孵育后，用化学发光荧光成像系统对图像进行扫描，最后对蛋白条带进行灰度值分析。
　　1. 7 统计方法应用
　　SPSS 17.0 统计软件进行数据统计分析。计量资料以均数 标准差(x s)表示，两组之间的比较采用t 检验法分析;多组间的比较采用单因数方差分析法分析，组间两两比较采用SNK-q 检验法分析。按=0.05 水平，以P0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 Rh2对LoVo细胞活性的影响
　　为了排除药物的细胞毒性或细胞增殖作用对迁移和转移功能的影响，首先采用MTT 法检测不同浓度Rh2 对LoVo细胞生长的影响。表1 结果显示：与空白对照组比较，采用浓度为5、10、20、40 mol/L Rh2 处理LoVo 细胞24 h 后，细胞生长无明显抑制，差异无统计学意义;当Rh2 浓度mol/L 处理24 h、浓度mol/L 处理48 h、浓度mol/L处理72 h 时，LoVo 细胞生长明显受到抑制，差异有统计学意义(P0.05 或P0.01)，提示人参皂苷Rh2 对LoVo 细胞活力的影响有时间和浓度依赖性。所以在后续实验中，把Rh2 作用浓度控制在40mol/L 以内，作用时间为24 h 进行研究。
　　2. 2 Rh2对LoVo细胞迁移能力的影响
　　结果显示：5 ~ 60 mol/L 浓度Rh2 对LoVo 细胞迁移的影响结果，随着药物浓度增加对细胞迁移能力的抑制增强，20 mol/L 以上浓度的Rh2 处理LoVo 细胞24 h，与空白对照组比较有显著抑制作用(P0.05)。
　　2. 3 Rh2对LoVo细胞转移功能的影响
　　结果显示：5 ~ 60 mol/L 浓度Rh2 对LoVo 细胞转移的影响，随着药物浓度增加对细胞转移能力的抑制增强， 20 mol/L 以上浓度的Rh2 处理LoVo细胞24 h，与空白对照组比较有显著抑制作用(P0.05)，结果与抑制迁移能力一致。
　　2. 4 Rh2对CD44、MMP-2、
　　TIMP-2、E-Cadherin、-catenin蛋白表达的影响
　　5 ~60 mol/L 的Rh2 对各蛋白表达的影响，随着Rh2药物浓度的升高，与空白对照组比较，CD44、MMP2蛋白表达水平显著下降(P0.05)，TIMP2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表达水平显著上升(P0.05)。
　　3 讨论
　　结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，晚期治疗效果不佳，恶性肿瘤发生侵袭和转移是最终导致患者死亡的主要原因。人参皂苷Rh2 单体能抑制癌细胞生长并诱导其凋亡，逆转其异常分化，抑制肿瘤转移能力，与化疗药物联合应用能提高疗效、减少副作用。本研究结果显示：一定浓度的人参皂苷Rh2 能显著抑制LoVo 细胞的迁移和转移能力，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强，结果与陶丽华、朴丽花、Kim 和姚兴军等关于人参皂苷Rh2 能显著抑制肿瘤细胞的迁移和转移能力的报道相一致。肿瘤细胞的转移能力与肿瘤细胞内异常表达的某些分子密切相关。-catenin 和E-Cadherin 基因介导细胞与细胞之间的黏附，与细胞黏附分子CD44 相互作用，它们的低表达有助于肿瘤细胞的扩散和转移[18-20]。而细胞基底膜的降解是肿瘤远处转移的重要因素，基质金属蛋白酶(MMPs)与组织抑制因子(TIMP)的平衡对维持细胞基底膜的完整具有重要作用。上调-catenin、E-Cadherin 基因表达，促进细胞黏附，下调MMP2 并同时上调TIMP2 基因表达，阻止细胞外基质的降解，并进而降低与肿瘤远处转移黏附分子CD44 基因的表达，可以起到抑制肿瘤侵袭与转移的作用。
　　恶性肿瘤的主要生物学特性之一就是肿瘤的浸润与转移，恶性肿瘤从原位增殖性病变发展到侵袭、转移等复杂过程，其与降解酶类、黏附分子、癌细胞运动能力及其受体等多种原因都分不开，细胞外基质的降解、基底膜完整性的破坏，是肿瘤细胞完成浸润转移的先决条件。阻止肿瘤细胞浸润扩散的天然屏障是基底膜，正常基底膜是由Ⅳ型胶原等成分构成的致密网状结构，固有细胞不能正常通过。细胞外基质的降解主要由蛋白水解酶来完成，基质金属蛋白酶MMPs 是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，能够降解基底膜，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。MMPs 活性的主要调节因子是组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，TIMPs 能够与激活状态的MMPs，即TIMP2 与MMP2 结合，从而能够抑制MMPs 的产生及其活性，是肿瘤发生恶变与转移的阻抑因素。陈磊峰等研究证实在原发性肝癌细胞中降低MMP2 的表达可以抑制肝癌细胞侵袭和迁移。王文祥等实验结果表明TMIP2 的表达与非小细胞肺癌伴淋巴结转移呈负相关，即伴有淋巴结转移的肺癌组织中TMIP2 的表达减弱。卢锦娥等研究说明在宫颈癌演变过程中，细胞通过TIMP2 表达水平的上调从而起到抑制癌细胞的浸润、转移特性。本研究结果表明：随着Rh2 药物浓度的升高，MMP2 蛋白表达水平下降，TIMP2 蛋白表达水平上升，二者维持在一个相对平衡稳定的状态，阻止了细胞外基质的降解，从而抑制了人结肠癌细胞LoVo 细胞的迁移和转移。
　　E-Cadherin 是广泛存在于各类上皮细胞中的钙依赖性跨膜糖蛋白，主要介导同型细胞间的黏附反应，除具有调节胚胎组织的发育、组织形成、参与细胞与细胞间信息传递交流等作用外，对促进细胞的黏附聚集、维持上皮形态结构完整性、维持细胞极性和参与分化调节也至关重要。E-Cadherin 在肿瘤细胞中的表达缺失使细胞间的同质黏附力下降，导致肿瘤易于扩散和转移。包俊杰等通过实验发现，从正常乳腺组织发展到乳腺癌组织再到腋窝转移淋巴结组织的过程中，E-Cadherin 表达逐渐减少。翁密霞等也通过实验结果表明，ECadherin的下调与缺失和非小细胞型肺癌的进展、分化及转移密切相关。吴继锋等的研究结果显示，E-Cadherin 表达与肿瘤的类型及分化有关，恶性程度越高、分化越差的肿瘤其E-Cadherin 丧失越明显。本研究结果表明：E-Cadherin 蛋白表达水平与Rh2 药物浓度呈正相关，也证明了Rh2 在抑制人结肠癌细胞LoVo 细胞的迁移和转移方面的作用。
　　-catenin 主要位于细胞膜，主要功能为介导细胞间黏附和参与基因的表达。李进展等研究发现，-catenin 在胃癌组织中的低表达率提示其与肿瘤转移的相关性，而E-Cadherin 与-catenin 的正相关表达与协同作用提示了它们在肿瘤恶性转移中的意义。本研究结果中，随着Rh2 药物浓度的升高，E-Cadherin 与-catenin 的表达也呈正相关性的增长，为Rh2 抑制人结肠癌LoVo 细胞的迁移和转移提示重要意义。
　　CD44 分子作为一种细胞表面跨膜糖蛋白的黏附分子，分布十分广泛。其主要参与细胞间及细胞与基质间的特异性粘连过程，在细胞的黏附、血管的形成和肿瘤的浸润和增殖中发挥重要作用。姚杰等通过对肺癌的淋巴结转移灶中CD44 的表达状态的研究，发现原发灶CD44 表达与转移淋巴结CD44 表达呈正相关，提示患者肺癌病灶中的肿瘤干细胞标记物CD44 表达越高，其发生淋巴转移的风险也就越高。本研究结果中，CD44 蛋白表达水平随着Rh2 药物浓度的升高而下降，再次验证了Rh2 在抑制人结肠癌细胞LoVo 细胞的迁移和转移方面的作用。
　　近年来，不止一种中药成方或中药单体被用于研究其对人结肠癌细胞LoVo 细胞侵袭或转移能力的影响，例如安昌勇等研究证实了槲皮素对人结肠癌细胞LoVo 细胞处理48 h 后，LoVo 细胞增殖、侵袭能力受到明显抑制，其半数抑剂量(IC50)值约为40 李素云等研究证实上海中医药大学附属医院的临床使用方扶正抑癌方含药血清大剂量组能有效降低LoVo 细胞侵袭力和运动能力;郭颖等研究证实了青蒿琥酯亦可抑制大肠癌细胞的侵袭能力。然而上述药物与人参皂苷Rh2 比较，人参皂苷Rh2 的用药剂量较小而且作用时间较快，具有明显优势，这无疑为临床结肠癌转移的治疗提供了新的方向。
　　综上所述，人参皂苷Rh2 在体外培养试验中证实能抑制人结肠癌细胞LoVo 细胞的迁移和转移能力，为临床结肠癌转移的治疗提供了依据，然而其抑制肿瘤转移的具体作用机制仍有待进一步研究证实。