谈川芎素对结直肠癌Lovo细胞生长的体内外抑制作用及机制

　　中药是我国的特色治疗方式之一，目前已有多种中药制剂获批用于常规手段无效时的肿瘤治疗。川芎素广泛用于心脑血管疾病的治疗，近年来其抗肿瘤活性成为研究的热点。川芎素对人结直肠癌是否具有抑制作用，目前尚不明确。2015 年5 月  2016 年5 月，我们在体内外观察了川芎素对结直肠癌Lovo 细胞的抑制作用，并探讨其可能的机制。
　　1 材料与方法
　　1. 1 材料
　　川芎素( 阿魏酸钠) 成都制药一厂生产，100 mg /支，工作浓度100 mg /mL，人结直肠癌Lovo 细胞购自中科院细胞库，RPMI 1640 培养基购自GIBCO 公司; AnnexinⅤ-FITC /PI 试剂盒购自南京凯基公司，鼠抗人pro-Caspase3 单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2 单克隆抗体购自Santa 公司; SPF 级裸鼠购自上海实验动物中心。
　　1. 2 实验方法
　　1. 2. 1 细胞培养与分组处理37  、5% CO2下将Lovo 细胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培养基培养，将对数生长期的细胞分为两组。观察组分别与终浓度为0. 125、0. 25、0. 5、1. 0 mg /mL 川芎素共培养，对照组不加川芎素。
　　1. 2. 2 Lovo 细胞活力观察采用MTT 法。将对数生长期的细胞制成1 105 /mL 的细胞悬液，以100L /孔接种96 孔板，分组处理同1. 2. 1。培养24 h每孔加入5 mg /mL 的MTT 20 L，孵育6 h 每孔加入20%的SDS 50 L /孔，过夜，测定570 nm 吸光度( A) 值。细胞活力指数= ( 观察组A570 /对照组A570) 100。
　　1. 2. 3 Lovo 细胞周期检测取对数生长期Lovo 细胞，分组处理同1. 2. 1。培养24 h 后以70% 冰乙醇固定细胞，4 碘化丙啶避光染色30 min，用FACSCalibur检测细胞周期。
　　1. 2. 4 Lovo 细胞凋亡检测取对数生长期的Lovo细胞，分组处理同1. 2. 1。分别于培养6、12、24 h，以3 000 L 1 缓冲液[100 mmol /L HEPES ( pH7. 4) ，1. 4 mmol /L NaCl，25 mmol /L CaCl2]悬浮细胞，调整细胞密度为1 106 /mL。取100 L 细胞悬液到流式管，加入5 L AnnexinV-FITC 和10 L PI( 20 g /mL) ，避光孵育20 min，加入400 L PBS 后用FACSCalibur 检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。
　　1. 2. 5 川芎素体内抑瘤作用观察取裸鼠14 只，于其左腋下靠背部皮下注射Lovo 细胞悬液100 L。10 d 后待肿瘤体积至约100 mm3，随机将裸鼠分2组各7 只。观察组静脉注射0. 5 mg /mL 的川芎素50 L，对照组静脉注射等量生理盐水，隔日给药7次。给药前及给药后每隔2 d 测量裸鼠瘤体长径( L) 和短径( W) 。肿瘤体积( mm3 ) = 1 /2W2 L。
　　1. 2. 6 Lovo 细胞及肿瘤组织Bcl-2、pro-Caspase3 检测采用Western blot 法。取对数生长期Lovo 细胞随机分为两组，观察组与终浓度1 mg /mL 的川芎素共培养，对照组不处理。收集培养24 h 后的细胞，并分离两组裸鼠肿瘤组织; 抽提蛋白，SDS-PAGE 电泳后转PVDF 膜，5% BSA 封闭; 加入1  4 000 稀释的鼠抗人Bcl-2 单抗或1  5 000 稀释鼠抗人pro-Caspase3单抗，以1  2 000 稀释的鼠抗人-actin 作内参，4  孵育过夜; 加1  2 000 稀释的HRP 标记的二抗，室温孵育1 h; 洗膜，检测并扫描，以目的条带与内参条带的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。
　　1. 3 统计学方法采用SPSS15. 0 统计软件。结果以珋x s 表示，数据比较采用单因素方差分析及LSDt检验。P 0. 05 为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 川芎素对Lovo 细胞活力的影响观察组分别与终浓度为0. 125、0. 25、0. 5、1. 0 mg /mL 川芎素共培养24 h 后，其细胞活力指数分别为81. 23 6. 58、75. 69 6. 34、62. 18 3. 29、58. 39 2. 69。终浓度0. 125 mg /mL 与终浓度0. 5、1. 0 mg /mL 的细胞活力指数比较，P 均 0. 05。其他浓度间比较，无统计学意义。
　　3 讨论
　　目前，川芎素已广泛用于治疗脑血管病、冠心病、白细胞和血小板减少症等疾病。川芎素药理作用复杂，研究表明其具有抗氧化及抑制血栓形成等效果，还有报道川芎素能够抑制氧化导致的平滑肌细胞增殖，但是川芎素和肿瘤细胞生长的关系研究较少。本研究结果发现，隔日瘤内注射0. 5 mg /mL 川芎素治疗荷Lovo 细胞豚鼠，7次用药后，与对照组比较，其肿瘤体积明显缩小。这表明Lovo 细胞的生长能被川芎素抑制，与本研究MTT 实验结果相互印证。G1 /S期和G2 /M 期是细胞周期两个重要检测点，在此期能够发现DNA 的损伤甚至突变，阻滞受损的细胞于相应位点上并进行修复DNA，只有DNA 修复完好后，接下来的细胞周期事件才能顺序进行; 如修复不能完成，则会引发细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，观察组Lovo 细胞经不同浓度川芎素作用24 h 后，G1期细胞比例减少显著，S 期细胞呈明显堆积，且细胞凋亡率增加。表明川芎素既能阻滞细胞于周期当中，又能引发细胞凋亡。
　　作为细胞凋亡的通路之一，线粒体途径中有与凋亡相关的蛋白被线粒体释放，整个过程由Bcl-2 家族的蛋白调控。凋亡抑制蛋白与诱导蛋白都是Bcl-2 家族成员，Bcl-2 是凋亡抑制蛋白，抗癌药物的敏感性受其表达水平的影响。Caspase 依赖性凋亡的执行者是Caspase3，其由胞质中的pro-Caspase3 剪切而来，核酸内切酶CAD 进而被激活，发生染色质聚集、DNA降解等生物学效应。本研究结果发现，川芎素能够降低Bcl-2 及pro-Caspase3 水平，凋亡抑制可被Bcl-2 低水平表达解除，降低pro-Caspase3 后Caspase3 活化水平升高，最终引起细胞凋亡。
　　综上所述，川芎素阻滞了人结直肠癌Lovo 细胞在S 期，并抑制Bcl-2 的表达，Caspase3 被激活，细胞转入凋亡步骤，在体内外抑制Lovo 细胞的生长。