小球藻是一种普生性单细胞绿藻，在自然界分布广泛，营养需求简单，可利用光照进行自养生长，也可利用有机物进行异养生长。藻细胞内含有丰富的氨基酸、藻蛋白、生物多糖和多种维生素、不饱和脂肪酸及矿物质，具有降血脂、降血压，增强免疫力，抗肿瘤等多种保健功能。由于其生长速率，光合效率，比表面积和积累油脂含量高于其他油料作物，而被广泛用于研究微藻油脂的积累。碳、氮、磷和某些金属离子对小球藻的生长和油脂的积累有重要的作用，其中研究较多是氮源因素。氮源是藻类生长发育所必须的重要营养元素，不同的藻种对氮源的要求有差异，氮源的种类和浓度发生变化，会影响微藻，如微藻的生长，油脂含量，脂肪酸成分等生理生化特征的改变。王顺昌等认为尿素有利于蛋白核小球藻的生长及其色素积累，而硝态氮则利于其中性脂肪酸积累。朱义平等发现低浓度NaNO3可使小球藻油脂含量增多; 丙氨酸可促使生物量增多，但油脂含量有所下降; 酪氨酸可降低细胞生物量，但油脂含量较高。Cha等证实在低氮条件下，小球藻产生的油脂含量有所增多。通过研究发酵过程中不同氮源对小球藻细胞生长和油脂积累的影响，确定了小球藻的最适培养条件; 并以此为基础，研究了含氮培养和缺氮培养下，小球藻氮消耗、生物量、油脂含量、生物量对氮得率和相对油脂对氮得率的变化，以探索通过改变氮源，调控小球藻细胞内组分的手段。 1 材料与方法 1. 1 菌种与培养基 小球藻Chlorella vulgaris C95，购自中国海洋大学。BG11 培养基[13] ( g /L) ，NaNO3 1. 50、K2HPO40. 04、MgSO4·7H2O 0. 075、CaCl2·2H2O 0. 036、Citric acid 0. 006、Ferric ammonium citrate 0. 006、EDTANa20. 001; Na2CO3 0. 02、微量元素混合液A5( mg /L) : H3BO3 2. 86、MnCl2·4H2O 1. 86、ZnSO4·7H2O 0. 22、Na2MoO4·2H2O 0. 39、CuSO4·5H2O0. 08、Co( NO3)2·6H2O 0. 058; 无氮BG11 培养基( BG11-N) ( g /L) : 以等浓度的NaCl 替代BG11 中的NaNO3，其他成分等同BG11。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 种子培养 挑取固体平板上培养的藻株至含有1 mL BG11培养基的试管中，混匀。取适量接种于含有10 mL培养基的100 mL 三角瓶中，置于恒温光照摇瓶柜中培养，培养条件为: pH 7. 5，温度28 0. 2 ，光照强度4 000 lx，以16 h 8 h 的光周期给予光照，以110r /min振荡培养。 1. 2. 2 氮源优化的培养 1. 2. 2. 1 添加不同氮源种类的藻细胞培养 将培养至对数生长期的藻细胞悬浮液，接种于含200 ml 已灭菌的无氮BG11 培养基( 氮源浓度为0 mg /L) 的500 mL 三角瓶中。分别添加NaNO3、NH4Cl 和CO( NH2)2作为氮源，调整其浓度等同于，采用BG11 培养基培养的氮源浓度( 1. 50 g /L) 。调整初始pH 为7. 5，初始接种浓度为吸光值0. 35 0. 05( OD680 nm) ，于温度( 28 0. 2 ) ，光照强度4 000 lx，16 h 8 h 的光周期下，培养8 d。 1. 2. 2. 2 不同氮源底物浓度下藻细胞的培养 将培养至对数生长期的藻细胞悬浮液，接种于含200 ml 已灭菌的无氮BG11 培养基的500 mL 三角瓶中。以C. vulgaris C95 最适氮源种类为氮源，调整氮源浓度，分别为0. 4 g /L、0. 8 g /L、1. 2 g /L 和1. 6 g /L，其他培养条件同方法1. 2. 2. 1。 1. 2. 3 含氮培养 收集培养至对数生长期的藻细胞，接种于含有200 mL 优化的BG11 培养基的500 mL 三角瓶中。调整初始pH 为7. 5，初始接种浓度为吸光值0. 35 0. 05 ( OD680 nm) ，于温度( 28 0. 2) ，光照强度4 000 lx，16 h 8 h 的光周期下，培养6 d。 1. 2. 4 缺氮培养 收集培养至对数生长期的藻细胞，接种于含有200 mL 的优化BG11-N 培养基的500 mL 三角瓶中。其他条件同1. 2. 3。 1. 2. 5 生物量的检测 根据黄美玲等的方法建立藻体干重与OD680 nm的关系曲线，公式为y = 358. 70x - 11. 691，R2 = 0. 9983( y 为藻体干重，mg /L，x 为藻体的光密度( OD680 nm) ) 。培养期间每24 h 取样，采用分光光度计检测680 nm 下藻体的光密度( OD680 nm) 。 2 结果与讨论 2. 1 不同氮源对小球藻生长及油脂含量的影响 2. 1. 1 不同氮源底物对C. vulgaris C95 生长影响的比较 以BG11 培养基为基础，选择NaNO3、NH4Cl 和CO( NH2)2作为氮源底物，培养C. vulgaris C95，连续培养8 d。考察3 种氮源底物对C. vulgaris C95 细胞生长和油脂含量的影响。3种氮源底物下，C. vulgaris C95均能正常生长并获得较高生物量。在( 0 7) d 内，C. vulgaris C95 的生物量随着培养时间的延长而增多，第7 d 时达到最大。随后，生物量下降。其中，以NaNO3为氮源底物的效果最好，最终生物量为488. 9 mg /L，氮源效果依次为CO( NH2)2和NH4Cl。3种氮源底物下，C. vulgaris C95 积累的油脂各不相同。其中，氮源底物为NaNO3时，油脂积累均高于其他氮源，油脂含量为9. 79%，氮源效果依次为NH4Cl 和CO( NH2)2。研究发现，培养小球藻时，铵离子代谢会影响藻细胞悬浮液的pH变化，偏离最适pH，使藻细胞的光合作用受阻和碳氮代谢失调，导致藻细胞的生长受到抑制。以CO( NH2)2为氮源底物时，高浓度CO( NH2)2的`对小球藻的生长有抑制，导致小球藻在1. 5 g /L 的氮源中生物量较低。综合比较C. vulgaris C95 生长和油脂积累情况，选择NaNO3作为培养小球藻的氮源底物。 2. 1. 2 氮源底物浓度对C. vulgaris C95 油脂积累的影响 以NaNO3为氮源底物，氮含量分别为0. 4 g /L、0. 8 g /L、1. 2 g /L 和1. 6 g /L，培养C. vulgaris C95。考察了C. vulgaris C95 在不同NaNO3浓度下细胞生长和油脂积累的情况，培养8 d 时，1. 6 g /L NaNO3为氮源培养小球藻的生长情况最佳，其生物量高达为562. 2 mg /L。其他氮源培养小球藻效果高低依次为1. 2 g /L、0. 8 g /L 和0. 4 g /L。以油脂含量为考察主体时，0. 8 g /L NaNO3为氮源培养小球藻，获得油脂含量最多为12. 01%; 1. 2 g /L NaNO3为氮源培养的次之，为9. 79%; 0. 4 g /L 和1. 6 g /L NaNO3为氮源培养的小球藻获得油脂含量分别为9. 06% 和9. 64%。但培养至第6 d 时，0. 4 g /L NaNO3培养小球藻，获得油脂含量高于其他氮源。可见，在不同培养时间下，不同浓度的氮源，对小球藻油脂含量的积累有所不同。为获得较高油脂含量的小球藻，采用0. 8 g /L NaNO3作为培养小球藻的氮源底物。 2. 2 含氮培养下小球藻对氮的利用效果 以0. 8 g /L NaNO3培养小球藻C95，考察了氮消耗、生物量和油脂含量的变化，及生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率，随着生长的进行，小球藻对氮的消耗在不断增加，随后趋向平稳; 小球藻的生物量和相对油脂含量逐渐增大，至第6 d 达到最高，分别为626. 3 mg /L和11. 68%。随后生物量和相对油脂含量迅速下降。在氮的消耗迅速下降时，小球藻的生物量却逐渐增多，其原因可能为小球藻吸收的氮元素，需经过一定的蛋白转化为谷氨酰胺或谷氨酸等，才能被小球藻的生长所利用的有机物质。另外，由于蛋白的合成和氮元素的转化需要一定的时间，导致氮的消耗与生物量的积累呈现的趋势不相同。小球藻的生物量氮消耗率和油脂氮消耗比率逐渐增大，至第6 d 达到最大，分别为0. 45 和0. 07。两者呈现相同的趋势，原因为小球藻的生物量和油脂积累同时增加和减少。 2. 3 缺氮培养对小球藻的生长和油脂含量的影响 以缺氮培养小球藻C95，其生物量、油脂含量和氮消耗。小球藻的生物量第2d 时，达到最大生物含量332. 8 mg /L，随后逐渐减少; 小球藻的油脂含量逐渐增大，第5 d 时达到最大，为13. 49%; 小球藻对氮的消耗在不断增加，随后趋向平稳。本研究发现藻在低氮浓度培养油脂含量高，此结果与当前报道大多数结果基本一致。同时缺氮培养时，达到最大油脂含量时只需5 d，比文献报道结果相比，约节省50%的培养时间，这为培养小球藻生产生物柴油提供了重要的理论依据。生物量氮消耗率，在第2 d 时，达到最大为4. 72; 油脂氮消耗比率在第5 d 时，达到最大为0. 85。生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率的趋势主要取决于生物量和相对油脂含量的走势。 含氮培养时可获得较高的生物量，其生物量约为缺氮培养的1. 9 倍; 获得较高油脂含量需采用缺氮培养小球藻，其油脂含量比含氮培养的高约15%。根据图4 和图6 可知，缺氮培养获得生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率要高于含氮培养，其原因为缺氮培养的藻液中含有的氮元素较低，导致生物量和油脂氮消耗比率较高。另外，缺氮培养时，油脂含量较高，也是导致油脂氮消耗比率较高的原因。 3 结论 在正常培养中，小球藻C95 以1. 6 g /L NaNO3为氮源时，可达最高生物量562. 2 mg /L，最大油脂含量是以0. 8 g /L NaNO3为氮源。缺氮培养时，最大相对油脂含量为13. 49%，比含氮培养高约15%;含氮培养时，最高生物量为626. 3 mg /L，比缺氮培养高约1. 9 倍。 在积累油脂的藻类中，细胞内油脂积累往往与氮源胁迫有关。本研究表明，以获取微藻生物量为目的，可通过含氮培养; 以获取微藻油脂为目的，则可采用缺氮培养。发酵培养过程中可通过改变氮源调控微藻生理代谢流向，以达到增强细胞内主要营养成分合成的目的。
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