周斌揭示细胞的命运，从哪里来？到哪里去？

　　原创 药明康德 药明康德  2022-12-17 11:47   发表于上海
　　从古至今，无数人喜欢在夜晚抬头仰望漫天的繁星，宇宙的未知与神秘似乎就已经一览无余。随着科技的发展，当人类通过天文望远镜看到了无数以光年为计的遥远星系，才发觉宇宙的浩瀚，与人类的渺小。
　　唯有科技才能带领人类突破眼界与思维的局限，颠覆传统的认知，在微观世界亦是如此。生命科学领域也同样蕴藏着许多的未解之谜。体内的细胞系如同浩瀚宇宙中无数的星系，它们究竟从哪里来，又将到哪里去？
　　来自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的周斌研究员深耕 ＂遗传谱系示踪技术＂多年。他所发展的新一代示踪策略成功揭示了体内冠状动脉和心肌细胞的起源与命运，为探索器官原位再生研究，打开了一片新的天地。
　　在今日揭晓的2022年第十六届药明康德生命化学研究奖中，周斌研究员由于利用双同源重组系统在心脏再生研究中作出了重要贡献而被授予本届＂杰出成就奖＂。
　　周斌研究员
　　2002年毕业于浙江大学医学院临床医学系并获得硕士学位；2006年毕业于中国医学科学院中国协和医科大学并获得博士学位；2006年至2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究；2010年9月起至2016年8月任中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员；2016年9月起至今任职于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）研究员。周斌研究组主要开发遗传谱系示踪新技术，研究哺乳动物体内细胞起源及命运调控机制，代表性研究工作多次在  Nature、Science、Nat Med、Nat Genet  等国际学术期刊上发表。周斌研究员曾获得国际心脏研究会ISHR＂杰出研究员奖＂、中国青年科技奖、科学探索奖等多项奖励。
　　遗传示踪——与细胞命运的不解之缘
　　小时候，周斌的理想是成为一位医生，救死扶伤。高考时，周斌选择了临床医学专业。十载寒窗，临床学习和实习经历让周斌逐步认识到，还有很多疾病尚未能得到真正有效的治疗，而这些未竟的临床问题需要更深层次的科学研究去探索和回答。
　　在浙江大学医学院临床医学系攻读5年后，周斌以优异的成绩被保送到中国协和医科大学攻读博士学位，师从著名干细胞专家韩忠朝教授，开启了对干细胞的研究。众所周知，人类的骨髓干细胞具有很强的分化潜能，在特定的生理和病理条件下，这些干细胞可以被诱导分化成不同类型的细胞，对于一些损伤修复有着巨大的应用前景。为了能够深入观测到干细胞进入相关组织和器官后的情况，必须对其进行精准示踪。从此，周斌与追寻＂细胞的命运＂结下了不解之缘。
　　当时的示踪手段以简单的荧光染色为主，这种蛋白水平的标记有着一定的局限。当时美国哈佛大学一位知名科学家曾声称，发现骨髓中存在干细胞能分化成为心肌细胞，找到了促进心脏再生的心肌干细胞。国际上对此存在很多不同的声音，却难以有明确的定论。彼时的周斌还是＂神仙打架＂的旁观者，他不知道的是当时这个悬而未决的争议，多年以后，最终会在他的手中得以尘埃落定。
　　博士毕业后，周斌远渡重洋去往美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院，进入William Pu博士实验室，聚焦于心脏发育及损伤修复。在这里他开始学习 ＂遗传谱系示踪＂（genetic lineage tracing）技术，利用遗传学技术来标记和示踪体内细胞，真正掌握了揭示细胞命运的＂钥匙＂。
　　顾名思义，＂遗传谱系示踪技术＂是通过遗传学方法，在基因水平上插入标记基因，并诱导其表达出能被检测到的荧光蛋白。与简单的染色不同，这种标记是永久的，因而相关谱系细胞类群及其子代细胞都将永久被这种基因标记和示踪，相关细胞的后代们都会持续表达报告基因，比如荧光蛋白。通过检测标记信号，就能够解析特定细胞谱系的起源和命运。
　　如何进行特定转基因小鼠的设计和建模，是＂遗传谱系示踪技术＂应用中最关键的基础性工作。当时尚未有完善的商业化小鼠模型定制，一切都需要研究者从头做起，因此周斌经常会因构建转基因小鼠模型而彻夜不眠。＂我在4年间做了10个转基因小鼠，有时候赶进度就需要通宵。＂虽然科研任务繁重，但周斌在自己热爱的领域里乐此不疲，快速成长着。谈及这段学习经历时，周斌颇为感慨。正是当时有限的科研条件，让他能够从整体到细节亲力亲为，有机会去遇见各种技术困难并一一攻克，从根本上掌握了遗传谱系示踪技术的设计策略和优化方法，为后期的科研突破打下了坚实的基础。
　　重大发现——揭示冠状动脉血管的新起源
　　2014年，国际顶尖学术期刊《科学》上发表了一篇名为De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart的文章，其中的研究成果颠覆了心血管领域以往的认知，被国际权威专家评价为＂领域的重大突破＂。这篇文章正是出自周斌的课题组。
　　关于冠状动脉的起源，以往普遍认为出生后的冠状动脉血管来源于胚胎期早已形成的冠状动脉血管的扩增，但冠状动脉的发育过程在体内难以被精确地追踪，多年来，这种假设并没有被严格地论证过。
　　在这项研究中，周斌团队首次利用遗传谱系示踪技术揭示了冠状动脉血管的新起源——心内膜。研究发现，与之前科学界来源单一的假设有所不同，心脏中的冠状动脉按照起源不同，可以分为两个血管群：即位于心室壁外侧的第一冠状动脉血管群和心脏内部（包括心室壁内侧和室间隔）的第二冠状动脉血管群。第一冠状动脉血管群确实来源于胚胎心脏最初的静脉窦。心内膜则是第二冠状动脉血管群的起源，位于室间隔中的冠状动脉血管是在胚胎发育中期形成的，而心室壁内侧的冠状动脉血管则是在胚胎晚期和出生后新生成的。研究也揭示了胚胎期的心内膜干细胞分化和迁移的过程，明确了新生期心脏的冠状动脉血管能够迅速增多的来源和机制。
　　冠状动脉是如何发育的，这是一个对于心血管疾病具有重要意义的基础生物学问题。当基础生物学问题尚未得到论证的情况下，关于其上层的再生医学研究很容易变成＂空中楼阁＂，很难出现实质的突破成果。当机理明确后，科学家就能依此寻找新的治疗方法。
　　周斌的研究开创性地给出了清晰明确的冠状动脉发育脉络，重新定义了冠状动脉的生长方式并提供了血管新生的潜在研究方向，为心梗后血管再生医学治疗奠定了重要的理论基础。
　　正交策略——提升空间分辨率
　　起初，周斌所使用的体内细胞示踪技术主要基于Cre-loxP同源重组系统（用于转基因小鼠的构建）。虽然这种技术非常成熟，但它本身也存在一定的局限。如果一旦有微量的Cre表达在了其他细胞中即所谓的异位表达，那么谱系示踪结果的可靠性将大大降低，而这也正是近年来很多科学问题出现争议的主要原因之一。
　　▲Cre-loxP介导的谱系示踪技术的工作原理图
　　周斌在攻读博士期间所见证的＂神仙打架＂的争议就是其中之一——成体心脏中心肌细胞是否可以由干细胞转变而来？c-Kit+通常被认为是干细胞表面的特异性标记，此前有研究称成体心脏内存在c-Kit+干细胞，当心脏受到损伤后，这类细胞能够分化为心肌细胞。由于缺乏严格的细胞示踪实验数据支持，这个问题在全球学术界已争论了十多年之久。
　　周斌团队通过严密的设计和论证，证明了这是由于单重组酶系统依赖于单个基因调控元件的特异性低而导致的谱系示踪数据混淆。关键在于c-Kit+细胞群由两个亚群组成，c-Kit+心肌细胞和c-Kit+非心肌细胞。用于谱系追踪的单同源重组酶系统Cre-loxP同时标记了两个群体，但并不能区分c-Kit+非心肌细胞和c-Kit+心肌细胞，从而造成了实验结果的不可靠。
　　与探索宇宙一样，想要准确揭示＂细胞命运＂，就必须在生物体内准确定义时间与空间，而周斌清楚地知道，想要准确定义时空位置，单一的＂坐标＂是不够的。为了克服单一标记异位表达对示踪准确性的影响，周斌团队开始尝试双同源重组示踪技术，通过双坐标的正交策略可以让遗传谱系示踪在空间上更加精准。
　　团队利用Cre-loxP和Dre-rox设计了正交的双同源重组系统DeaLT（Dual-recombinase-activated lineage tracing），成功排除传统谱系示踪技术示踪c-Kit+成体干细胞时对于心肌细胞的异位标记，从而精确地得出c-Kit+成体哺乳动物非心肌细胞在生理或病理情况下均不能发生向心肌细胞转变的结论（ Nature Medicine , 2017）。接下来他继续发展了应用更为广泛的DeaLT，在不清楚是否有干细胞存在以及干细胞分子标记未知的情况下，利用双同源重组酶技术证明了成体心脏中心肌细胞来源于自我增殖，而非干细胞的分化（ Circulation  2018、2019）。
　　▲周斌团队通过DeaLT-IR策略对c-Kit+非心肌细胞（ZsGreen+）进行谱系追踪的示意图
　　该技术将Dre-rox同源重组系统与传统的Cre-loxP同源重组系统结合，Dre-rox介导的同源重组反应在可能引起Cre异位表达的细胞中将Cre重组酶的识别位点loxP切除掉，有效地阻止Cre-loxP的异位同源重组，增加Cre-loxP介导的谱系示踪结果的准确性。
　　周斌创建的谱系示踪新技术解决了近20年来国际心血管领域关于心脏干细胞与心肌再生的争议问题。国际心脏研究会（ISHR）每年都会在全球范围内评选出一位在心血管领域做出杰出贡献的科学家，2019年度＂ISHR杰出研究员奖＂这一荣誉授予了周斌。
　　双同源重组示踪技术作为更精准的谱系示踪技术，为多个研究领域更准确地解析细胞起源和命运提供了有效手段。基于这项技术，周斌课题组还对肝脏和肺脏开展了一系列示踪研究，揭示相关过程中各类细胞的起源和命运，填补了国际上相关理论的空白。
　　增殖追踪——空间特异性和时间连续性
　　与再生功能很弱的心脏不同，肝脏具有很好的再生能力，部分肝脏切除后，依赖其自我增殖可实现再生。但是究竟哪一群肝细胞具有较强的增殖能力？这个谜团长期无解，甚至出现相互矛盾的结论。对于周斌来说，这是一个非常有趣同时也富有挑战的研究方向。
　　与仅追踪单一细胞谱系的命运有所不同，示踪肝脏这样一个完整器官的再生涉及到对多个细胞谱系增殖情况在一段时间内持续性的观测，这样才能够揭示不同区域的肝细胞对整体器官再生的贡献。为了体内细胞增殖示踪能够有更好的时空分辨率，周斌团队基于此前正交双同源重组酶（Cre和Dre）的优势，开发出一种遗传增殖谱系追踪方法——ProTracer（proliferation tracer）。通过利用肝细胞特异性启动子，ProTracer能够在肝细胞这一特定细胞谱系中以高空间分辨率对细胞增殖事件进行记录，并成功实现空间特异性以及时间连续性。（ Science ，2021）
　　▲周斌团队设计的新遗传策略ProTracer与此前的策略的对比
　　Ki67 是一种细胞增殖状态标记，此前，最常见的策略是用三苯氧胺（Tam）启动标记的表达，但Tam的半衰期只有12-24h，随着时间的推移，Tam诱导的Cre活性下降，新增殖的Ki67+细胞会无法有效记录。如果通过持续几周或几个月的Tam给药，以有效地保持小鼠体内Cre的恒定活性在技术上具有挑战性，且可能会对组织产生毒性和不良影响。周斌团队设计新的ProTracer遗传策略，通过CRISPR-Cas9建立双同源重组遗传系统，用一个Tam脉冲启动该系统后，它将保持打开状态，并能够在此后的任何时间追踪Ki67+细胞——这个概念在理论上可以在动物一生中任何特定的时间窗口内连续记录细胞增殖。
　　▲周斌团队通过ProTracer遗传示踪技术记录的肝细胞增殖事件
　　通过对细胞增殖进行追踪，周斌团队在整个肝细胞群体水平上，在稳态和不同损伤修复模型中，观察到了高度区域性的和动态的肝细胞增殖模式，从全新的角度揭示了器官修复再生的调控机制，为肝脏损伤修复再生研究开辟了新思路，为肝脏疾病的治疗提供了新的理论基础。
　　▲周斌课题组用ProTracer技术示踪了多个器官和组织的细胞增殖
　　尤其值得一提的是，ProTracer能够在活体动物中对肝细胞增殖进行非侵入性的长期监测。这种不牺牲样品直接活体检测细胞增殖的方法，从多个维度刷新了细胞增殖检测的能力和范围，可以广泛应用于不同组织器官细胞增殖的检测，为发育生物学、肿瘤学、神经科学和再生医学等众多领域的研究提供了技术支撑，也为心肌细胞增殖检测提供了新的技术手段。
　　厚积薄发——广阔的应用前景
　　遗传示踪技术就像观察浩瀚宇宙的那架天文望远镜，但宇宙的奥秘依然需要科学家们坚持不懈地去探索和追寻。最近团队还开发了邻近细胞遗传学技术，实现了对邻近细胞的遗传示踪和操作（ Science  ，2022），为体内细胞互相作用研究提供了强大的技术支撑。从单同源重组到双同源重组，从细胞内到细胞间的遗传操作，从单一细胞谱系命运到多细胞谱系之间相互作用与命运调控，周斌的研究已拓展到更加广阔的未知领域。
　　▲周斌团队合影
　　谈及自己的科研理念，周斌说：＂做科研有时候要发挥愚公移山的精神，坚持做好一件事。坚持，才能做得更好＂。
　　面向未来，周斌表示将继续为科学界探索更先进的示踪技术，去揭示更多细胞命运的奥秘；发展邻近细胞遗传示踪技术策略，解析微环境对细胞分化和增殖的调控和影响，并进一步寻找促进心脏原位再生的新方法。我们期待，未来周斌与他的团队能够有更多的科研成果问世，为临床治疗提供更多理论支撑和技术创新，开启更广阔的天地。