单层细胞的传代

　　实验方法原理
　　去除培养基，加人胰蛋白酶短暂作用，孵育，以培养基分散细胞，计数，稀释并再接种。
　　实验材料
　　A549细胞 WI-38 MRC-5 胰蛋白酶 D-PBS
　　试剂、试剂盒
　　70%乙醇喷壶
　　仪器、耗材
　　生长培养基 吸管 离心管 培养瓶 移液器 吸耳球 吸水纸巾 吸管桶 抗乙醇记号笔 血细胞计数板
　　实验步骤 1. 准备超净工作台，将试剂及材料置于超净台，开始实验。
　　2. 仔细检査培养物有无污染或衰退迹象。
　　3. 依据标准和你对该培养物行为的了解，决定是否需要传代（做练习 13者应记录细胞密度和状态，如有丝分裂、多层、细胞变性）。若需要传代，如下进行。
　　4. 将培养物置于无菌工作区域，除弃旧培养基。各种细胞（A 549细胞，以 2×104 /ml 接种在 25 cm2 培养瓶中7 天和14天；WI-38，MRC-5，或同样正常二倍体成纤维细胞，以 2×104 /ml 接种在 25 cm2 培养瓶中7 天和14天）分开进行，每种细胞均重复从此以下步骤。
　　5. 为避免冲散细胞，沿培养瓶细胞面对侧加人 D-PBS/EDTA ( 0.2 ml/cm2）（D-PBS 含 1 mmol/L EDTA），清洗细胞，去除预洗液。这一步骤的目的在于去除残留血清，因为血清可抑制胰蛋白酶的作用，去除细胞黏附所需的二价阳离子。
　　6. 沿培养瓶细胞对侧面加入胰蛋白酶（0.1 ml/cm2 )（0.25 % ，D-PBS 配置）。翻转培养瓶平放。确保胰蛋白酶完全覆盖细胞层。静置 15~30 s。
　　7. 立起培养瓶，使胰蛋白酶离开细胞层，快速检査单层细胞是否尚未脱落。如果细胞未解离即脱壁就成问题，使用 4°C 胰蛋白酶可以防止该问题发生。
　　8. 吸走大部分胰蛋白酶，只留数滴。
　　9. 平置培养瓶孵育，直至细胞变圆隆起，倾斜培养瓶，单层细胞就会从培养瓶表面滑落（通常发生在 5~15 min 以后）。注意不要消化时间过长，另一方面也不要在细胞消化好前强制将细胞吹打下来，这样将导致细胞成片脱落。
　　10. 加人培养液（0.1~0.2 ml/cm2 )，反复以吸管（吸管，带刻度、塞棉花。如果是玻璃的，根据大小置于方细胞盒中，如果是塑料的，单个包装，分类放在架子上，用于吸除培养液的未塞棉花吸管，如果有泵和真空吸引管道的话）吹打单层培养细胞面以分散细胞。
　　11. 最后，将吸管的尖端放于培养瓶底角，上下吹打细胞几次，注意不要产生气泡。吹打的强度各个细胞系有所不同，有的细胞系很容易分散，而有的则需大力吹打才能分散。但若吹打力量过大几乎所有的细胞都会受到剪切力的机械损伤。原代或早期几代培养的细胞由于它们较脆弱和体积较大而尤其容易受到损伤，而连续细胞系通常有较大弹性，需要大力吹打才能完全解离。充分上下吹打以分散细胞使之处于单细胞悬浮状态。若这一步骤进行困难，选用更强的解离试剂。
　　传代过程中单细胞悬液是较理想的，它有助于保证细胞的计数准确和再接种后均一性生长。若要进行细胞增殖或贴瓶率的计数或进行细胞克隆分离，制备单细胞悬液是必需的。
　　12. 用血细胞计数板或电子细胞计数仪计数细胞并记录数值。
　　13. 稀释悬液直至合适的接种浓度。
　　(a) 加人适量细胞悬液到已有已知体积培养基（生长培养基，如1× MEM 加 Earle 盐、23 mmol/L NaHCO3，无抗生素）的培养瓶中，或
　　(b) 稀释细胞至所需的总体积，然后再分装到各个培养瓶中。
　　程序(a)适合常规传代，传瓶数不多且不需要准确的细胞计数和增殖能力测定，但若同时做多个相同的培养，程序(b)则更适合。因为操作的次数减少，每一培养瓶中细胞密度完全一致。
　　对于练习13 , 用(b)程序：用 20 ml 培养液稀释各瓶的细胞至 2×104/ml, 从每瓶细胞悬液中取 5 ml, 接种到 2 个培养瓶中。
　　14. 如果细胞在提高 CO2 的情况下（如材料中所列的 Eagle MEM 含 Earle’s 盐和 23 mmol/L NaHCO3）生长，则从提前混合好的混合气体瓶或气体混合装置通过过滤管注人正确的气体（此次是 5 % CO2）至培养瓶内培养基上面供气。注意不要将气体吹入培养基内，那样会产生气泡，气泡可能使培养基的某些成分变质，同时也会增加污染的儿率。如果正常气相是空气，用含 Hank 盐的 Eagle MEM 培养基，这一步骤可以省略。
　　15. 盖上培养瓶，放回孵箱中，大约一小时后检查 pH 的变化。若在空气相中培养基 pH 升高，则要将培养瓶移至无菌区域内，向其中快速（1~2 s ) 吹入 5 % CO2 。因为每一培养物的行为在相同的培养基中是已知的，最终会清楚传代时哪种细胞需要吹气，而不必首先孵育观察。如果在 5 % CO2 气相中培养基的 pH 还是升高（如本实验），可以增加 CO2 浓度至 7 % 或 10 % 或者加人无菌的 0.1 mol/L 的 HCl。
　　16. 从操作步骤 4 重复本程序，对第二个细胞系进行传代。
　　注意事项
　　在每种情况下， 主要的解离试剂， 不论是胰蛋白酶或是 EDTA , 仅做短暂停留， 去除大部分消化液后， 仅留少量消化液进行孵育。如果在分离细胞以及后续制备单细胞悬液过程中遇到困难， 可采用其他程序。
　　其他
　　本程序第 15 步不可作为传代后 pH 升高这一问题的长期解决办法，若问题持续存在，则在配置培养基时降低其 pH，同时检查在孵箱中或充气的培养瓶中培养基的 pH。