本质上单向化学燃料旋转分子马达

　　本质上单向化学燃料旋转分子马达
　　文章出处：Ke Mo, Yu Zhang, Zheng Dong, Yuhang Yang, Xiaoqiang Ma, Ben L. Feringa, Depeng Zhao. Intrinsically unidirectional chemically fuelled rotary molecular motors. Nature 2022, 609, 293-298.
　　摘要：生物系统主要利用化学能驱动自主分子马达，使系统脱离平衡状态。从细菌鞭毛马达和三磷酸腺苷合酶等旋转马达中获得灵感，在光驱动的单向旋转分子马达成功的基础上，科学家们开始着手设计完全由化学能驱动的合成分子马达。然而，设计使用化学燃料、同时具有内在结构设计元素、允许像三磷酸腺苷合酶那样进行360o单向旋转的人造旋转分子马达仍然是一个挑战。在这里，作者展示了一种具有三种不同立体化学元素的同手性联芳基化合物Motor-3，它是一种旋转马达，在化学燃料的驱动下，两个芳基围绕单键轴进行重复和单向360o旋转。它经历了酯环序、螺旋反转和开环，在自主旋转循环上实现了高达99%的单向度。分子旋转马达可以在两种模式下运行：与化学燃料的脉冲同步运动和酸碱振荡；在化学燃料存在的情况下在基本的水溶液条件下进行自主运动。这种旋转马达设计具有旋转方向的内在控制、自主运动的简单化学燃料和近乎完美的单向性，说明了未来多组件机器执行机械功能的潜力。
　　分子马达在生命系统中起着至关重要的作用，从能量转换、运动、细胞内运输到信号转导和视觉。在过去的几十年里，人造分子机器的设计和应用取得了显著的进展，使机械功能如马达、肌肉、运输器或泵得以实现。Feringa课题组报告了第一个基于过度拥挤的烯烃的光驱动旋转分子马达，而Kelly课题组同时用化学燃料的三联苯为基础的分子轮状结构展示了120o的定向旋转。由于这些开创性的研究，单向旋转在许多系统中实现了，包括Lehn的光驱动亚胺马达，Leigh的基于联锁大环的分子马达，Dube的半碘青旋转马达和作者的化学驱动单键旋转的单向马达。然而，与光能驱动的动力冲程系统不同，以单向方式设计连续和自主的化学驱动旋转马达仍然是非常具有挑战性的，尤其是因为关于单键的每个旋转状态的适当Gibbs自由能变化和活化能，即每个化学步骤的动力学，应该用一组反应精确控制。2016年，Leigh课题组报告了一种由化学驱动的自主分子系统，该系统基于一种带有偏置方向性的链烷，涉及布朗棘轮机制。然而，抑制随机布朗运动和设计一种类似ATP酶的自主分子马达，并利用化学燃料实现绕轴单向旋转的内在能力，仍然是难以实现的。作者的课题组基于联芳基结构设计了化学驱动的旋转分子马达，在芳基之间形成一个瞬态桥，促进了高单向性的阻旋异构构象相互转换，然而，这些系统需要控制保护基团或连续的化学步骤，不能自主操作。值得注意的是，在作者准备目前的手稿时，Leigh课题组报告了一种相关的方法，其特点是关于单个共价键的自主燃料定向旋转。对于完全自主旋转马达的设计(图1)，作者推断，立体选择环化反应和开环反应(联芳基体系中的桥形成和裂解)形成主要的动力学产物，对于设计连续旋转的分子马达，避免主要的随机布朗运动至关重要。单向性应该是系统固有的(如ATP酶)，并由顺时针和逆时针旋转所涉及的顺序反应速率的比率控制。
　　为了解决这些挑战，设计了一种新的联芳基分子马达家族，图1a给出了旋转分子马达(化合物Motor-3)的结构和基本操作特征。顺时针360o旋转过程包括两个环化步骤(步骤1和步骤4)，两个反环步骤(步骤2和步骤5)和两个开环步骤(步骤3和步骤6，图1c)六个步骤。联芳基的上环(转子)在邻位侧链处加入羧酸基团，下环(定子)采用两个酚醛基团。sp2-sp2芳基键的旋转受到三个邻位官能团的限制，以避免在没有燃料的情况下围绕单键的随机布朗运动。在处理与燃料，形成一个八元环内酯和分子内酚醛酯作为一个动态共价键基。每个环化(步骤1和步骤4)之后是水解步骤(步骤3和步骤6)，以完成一个完整的旋转循环(图1c)。转子芳基中的羧基与定子芳基中的一个羟基之间形成的酯通过碳二酰亚胺(DIC)转化为尿素(DIU)，促进了联芳基的转化。设计的关键除了双芳基手性外，还在于侧链上存在两个相邻的立体中心，分别控制环化和反转过程。因此，点到轴的手性诱导策略保证了环化和环翻转过程的单向性。
　　这里采用的第二个新原理是循环态的动态动力学水解(步骤2和步骤3)，理想势能图如图1b所示。当分子马达在强碱性条件下运行时，开环步骤的选择性由两个环态之间的能差(ΔG°)决定的不稳定与稳定异构体之比(热力学与动力学控制)控制。也就是说，当khydrolysis > k＂hydrolysis >> kinversion时，不稳定异构体与稳定异构体的比值将是同步步进运动中单向度对应的开环步骤的选择性(图1c)。当kinversion >> khydrolysis > k＂hydrolysis时，体系符合Curtin-Hammett原理，且单向度不完全取决于相互转换的环非对映体的相对比例；它是由对应于khydrolysis/k＂hydrolysis的各过渡态ΔΔG†的势垒差控制的。这种现象类似于不对称催化中的动态动力学拆分，称为动态动力学水解。对于后一种情况，当ΔΔG† > ΔG°时，开环步骤的选择性和方向性比前一种情况更大。
　　为了保证在获得化学能的情况下，化合物Motor-3中的联芳基C-C键能够持续旋转(图1c)，对所有动力学参数进行了微调，以确保环化和水解同时发生在同一反应混合物中，并且只要有燃料存在，分子马达就能够高效地连续旋转。需要强调的是，目前的分子马达是由运动驱动的，其工作机制与第二代光驱动分子马达类似，只是能量输入不同。
　　为了确定两个相邻的立体中心在苄基和羧基上的关键作用，合成了一系列模型化合物(化合物1、2、3和Motor-1)，并测定了环化(步骤1)和螺旋反转(步骤2)后的动力学/热力学(不稳定/稳定或简称K/T)异构体的比例。如图1d所示，化合物1在苄基位置只有一个单立体中心，对动力学异构体有很高的环化选择性(K/T > 20/1)，但双芳基螺旋反转比较差(K/T = 1/1.6)。相比之下，化合物2在羧酸-位具有单立体中心，环选择性较差(K/T = 1/1.9)，但联芳基转化率较好(K/T = 1/9.5)。以上结果清楚地表明，苯基位置的立体中心和羧酸位置的立体中心分别对环化和联芳基螺旋倒转起立体控制作用。作者推断，如果引入两个匹配构型的立体中心，在环化和反转过程中都可以获得较高的选择性。使作者高兴的是，同分异构体(S,S’)-Motor-1确实表现出高的环选择性(K/T > 20/1)，螺旋反转比良好(K/T = 1/4.1)。相反，反相异构体(R,S’)-3环化时，热力学产物的K/T = 1/15。通过对这些化学元素的精细平衡分析，作者发现化合物Motor-2与Motor-1相比，在苯基位置以-OH取代-OMe，反转势垒显著降低(ΔG° = 98.0 kJ·mol-1，t1/2 = 4.7小时，298.15 K)。图中给出了对马达进行评价的进一步实验细节，即不同异构体的NMR谱和单晶X射线衍射，以确定其绝对构型和构象分析。为了进一步提高旋转分子马达的速度，在联芳基(化合物Motor-3)的4,4’位置引入了一个电子丰富、空间要求更高的t-Bu基团。因此，化合物Motor-3活化的Gibbs标准自由能进一步降低到94.7 kJ·mol-1 (t1/2 =73分钟，298.15K)，螺旋反转比也提高到10/1。
　　图1
　　为了明确证明化学燃料驱动的分子马达围绕单键进行了360o的逐步单向旋转，每一步都需要下环(定子)的不对称来区分同分异构体(图2)。在分子Motor-1定子的手性磷酸催化剂的存在下进行单溴化，为化合物Motor-Br提供了高的立体选择性(d.r. > 25:1)。用单晶衍射法测定了相应甲酯Motor-Br-Me的相对构型。分子马达Motor-Br的360o旋转循环如图2所示，1H NMR研究的各个步骤显示了单向旋转循环中所有不同的异构体。在第1步中，(S,S’，aR)-Motor-Br在EDC存在下更倾向于与左羟基发生内酯化，而不是定子上的右羟基。将不稳定异构体trans-Motor-Br-K在CDCl3中65 oC加热2小时，得到稳定的trans-Motor-Br-T，并观测到良好的反转比(K/T = 1/6.3)。trans-Motor-Br-K经LiOH水解后进行180o单向旋转，得到(S,S’，aS)-Motor-Br-(S,S’，aR)-Motor-Br的萎缩异构体。因此，剩下的半循环可以通过相同的步骤顺序来实现(图2)。根据这些数据，可以清楚地看出，目前的化学燃料分子马达确实经历了阶梯式的360o单向旋转，6个异构体立体控制良好的顺序相互转换可以通过1H NMR波谱清晰地识别出来。
　　图2
　　在建立了马达3和阶梯式360o单向旋转的优化设计后，下一步作者寻求同步分子马达的阶梯式运行(图3)。建立了条件，确保所有的环化、双芳基翻转和水解反应在与马达3的反应混合物中依次发生。最初，当EDC (2.0倍当量)加入DCM (2.0 ml)和H2O (3.0 ml)的Motor-3溶液中，5分钟内80%以上的羧酸转化为动力学异构体Motor-3-K。然而，HPLC分析表明，由于螺旋倒置障碍低，约30%的动力学异构体转化为稳定的动力学异构体Motor-3-T (图3II)。接下来，加入20 μl浓HCl将体系酸化至pH = 2，5小时后，超过95%的动力学产物(Motor-3-K)转化为热力学异构体Motor-3-T。然后，加入2 mmol的NaOH调整体系的pH = 13，在20分钟内完成Motor-3-T的水解，使Motor-3显示完成单向180o旋转。其余的半循环由Motor-3使用相同的反应序列实现。如图3VII所示，经过6步后Motor-3完全恢复到初始状态，没有观测到任何杂质。在酸碱振荡条件下，添加EDC脉冲作为化学燃料，可以实现Motor-3的360o旋转同步运行。
　　图3
　　在明确证明了化学驱动、连续、同步和单向的步骤包括一个完整的360o旋转循环之后，作者接下来确立了旋转分子马达的连续、自主和单向操作方式。作者首先研究了循环状态的稳定异构体(khydrolysis)和不稳定异构体(k’hydrolysis)的水解速率，因为在连续旋转的条件下，如果kinversion >> k’hydrolysis > khydrolysis，该体系遵循Curtin-Hammett原理，单向度可能会受到影响(图4)。采用化合物Motor-1进行动力学研究，因为其相对较高的反转势垒可以避免水解过程中动力学和热力学异构体之间的相互转化。令人欣慰的是，稳定异构体的水解速率常数是不稳定异构体的47倍(图4a)。这意味着，如果动力学遵循kinversion ≥ khydrolysis > k’hydrolysis，作者可以根据Curtin-Hammett原理，利用水解速率的巨大差异来放大分子马达的单向性。用MOM保护的环异构体混合物(Motor-1-MOM-K/Motor-1-MOM-T = 4:1)进行了多次实验，以确认这种动态动力学水解(图4b)。当水解反应在0.5 M的K3PO4水溶液及t-BuOH中于50 oC下进行时，与反应物的d.r.比(4:1)相比，产物的d.r.比(21/1)确实提高了。相反，当循环异构体混合物以LiOH处理为对照实验时，由于水解速率远快于反转速率(khydrolysis > k’hydrolysis >> kinversion)，产物的d.r.比同反应物的d.r.比相同(都为4/1)。
　　在目前的系统中，由于作者已经证明了分子马达经历了包含6个不同的异构体的360o单向逐步旋转，分子马达在连续旋转模式下应该表现出相同的性质。然而，应该开发条件，以确保水解和环化可以在相同的反应混合物中发生，允许分子马达以一种有效的方式工作，而不影响单向旋转循环。作者根据两个原则建立合适的条件：1) 由于分子马达的转速和单向度依赖于一组反应速率常数(kcyclization、kinversion、k’hydrolysis和khydrolysis)，所以kcyclization和khydrolysis的数值应与kinversion的数值相近，以避免限速步骤远慢于其它步骤；2) 为了避免动力学异构体的水解，kinversion应远远大于k’hydrolysis (kinversion >> k’hydrolysis)。在此基础上，作者建立了适合化合物Motor-3的环化和水解的条件：2 M的K3PO4水溶液，t-BuOH和二恶烷(5: 3: 2 v/v/v)。现在，在相同的溶剂混合物中，水解过程可以发生，同时环化也在DIC和HOBt存在的情况下发生(图4c)。在建立了优化的连续旋转条件下，测定了35 oC下螺旋反转的反应速率常数和环化水解的表征速率常数(kinversion = 1.34 × 10-4 s-1，t1/2 = 86.1 分钟，kcyclization = 3.47 × 10-3 s-1，t1/2 = 33.3 分钟，khydrolysis = 7.28 × 10-5 s-1，t1/2 = 159 分钟)。在过量DIC存在的情况下，水解是旋转循环中最慢的一步，也是决定速度的步骤。这些结果清楚地表明，速率常数满足作者上面指出的标准(图4)。
　　进行连续旋转实验，HPLC监测过程如图4d所示。在起始点，将DIC和HOBt分批加入Motor-3的t-BuOH、二恶烷和2M的K3PO4水溶液的混合溶剂中。1小时内，两种环异构体均被检测到，均可视为远平衡态。从4小时到9小时，这个失衡的体系达到了一个稳定的状态，所有异构体的比例大致不变。在9-12小时，随着DIC浓度的降低，观测到的环化速率降低，导致动力学同分异构体与热力学同分异构体的比值(K/T)略有降低。随着化学燃料(DIC)的消耗和循环异构体的彻底水解，该体系在12-24小时内恢复到初始平衡状态。如果燃料量超过马达，分子马达将继续旋转。最后测定了燃料本底反应DIC的水解速率(khydrolysis = 5.64 × 10-5 s-1，t1/2 = 204分钟)，远低于kcyclization (3.47 × 10-3 s-1)。这意味着分子马达是一种很好的燃料分解催化剂，根据速率，作者可以确定98%的DIC在早期阶段被消耗，并且随着Motor-3的游离酸形式浓度的降低，比例下降。在360o自主单向旋转时，单向度由两组高选择性环化反应和水解反应的动力学决定，因此单向度可计算为：(khydrolysis/k’hydrolysis)2 × (kcyclization/k’cyclization)2 = 472 × 202 = 8.8 × 105/1，其中kcyclization/k’cyclization为环化后K/T之比。
　　图4
　　总之，作者开发了一种自主的单向旋转分子马达，以化学能为燃料，利用了系统中的固有手性元素，该系统主要由动力学控制，不同于通过小偏差操作的系统，主要是布朗运动。虽然作者的光动力马达的转速还远远没有达到纳秒级，但作者希望这里展示的设计原则将与其它几种化学转化和燃料兼容，并可能促进化学动力旋转马达的发展，以实现广泛的机器类功能。