PCR的应用（作用）鉴定目的基因的正向插入

　　PCR的应用(作用)
　　①构建融合基因
　　②用于定点突变
　　③添加酶切位点
　　④定量检测(检测RNA或DNA)
　　⑤扩增DNA已知DNA片段两侧的位置序列
　　⑥配合 Klenow酶 制备DNA探针
　　⑦鉴定目的基因是否定向插入(正向或反向都可鉴定，设计一个引物在质粒上，另一个引物在目的基因上)
　　1．PCR中使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3＂端加上多聚A。PCR扩增过程中，由于不清楚目的基因的完整DNA序列，获得的目的片段通常需要重组到T-载体中，通过测序了解DNA序列。LacZ基因在IPTG诱导下的表达产物能够水解X-gal使菌落呈蓝色，否则呈白色。目的基因插入到LacZ中会导致该基因失活，因此可采用蓝白斑法筛选含有重组质粒的大肠杆菌。下图为T载体的结构示意图（Amp＂为氨苄青霉素抗性基因）。下列说法正确的是（　　）
　　A．为高效连接PCR扩增产物，T-载体用EcoRV酶切后再在3＂端添加多聚T突出端
　　B．通过设计特定的引物借助PCR技术可检测PCR扩增产物在T-载体中的插入方向
　　C．选择BamHI和HindIII进行双酶切并构建基因表达载体以保证扩增产物正向插入
　　D．转化后，应选择在含X-Gal和氨苄青霉素培养基上生长的白色单菌落进行测序
　　2．纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
　　(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是______________________________________。
　　(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mo1/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
　　(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
　　分步实验目标
　　简易操作、结果、分析
　　PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
　　①选择图Ⅱ引物_____________；②PCR目的产物约为_____________bp。
　　确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列
　　③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号）
　　检测融合蛋白定位
　　④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明_________________________________________________________
　　(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。