来看如何简单可靠灵敏特异测定HO释放

　　该篇实验方法已经在  eLife  文章＂Mesenchymal stromal cell aging impairs the self-organizing capacity of lung alveolar epithelial stem cells＂中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在 Bio-protocol  期刊，欢迎大家进入 Bio-protocol  期刊直接与作者交流。 简 介
　　在这篇Bio-protocol文章中，来自美国伯明翰大学和杜兰大学的研究人员为我们描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的H₂O₂的方法。
　　亮 点
　　1.该方法与目前利用荧光染料检测细胞内 H₂O₂的方法不同，该方法具有特异性和灵敏度，检测范围在纳摩尔范围内。
　　2.该方法能够在活细胞、类器官或组织中进行 H₂O₂的快速检测，可以在几分钟到几小时内计算出 H₂O₂的稳态释放速率。
　　3.该方法成本低，储存保质期长，相对于商业试剂盒来说更加经济实用。
　　背景介绍
　　活性氧（ROS）在自然界中普遍存在，在生物系统中作为信号分子发挥作用，还可能导致几种病理生物疾病状态下的氧化应激。因此，对ROS的研究在生命科学领域至关重要。众所周知，ROS可能来自细胞内多种酶促和非酶促代谢反应。细胞内的细胞器如线粒体、内质网、微粒体和过氧化物酶体都含有产生ROS的酶，且细胞主要通过超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用来对抗过量的ROS。
　　目前已公认，ROS诱导调节细胞信号转导的蛋白质翻译后修饰，被称为＂氧化还原信号＂。在过去的25年里，NADPH氧化酶（NOX）家族的发现进一步阐明了氧化还原信号传导领域。这些新型酶的主要催化功能是调节ROS的生成，特别是超氧阴离子（ O₂.-）和过氧化氢（ H₂O₂）的生成。由于 H₂O₂可以直接影响介导信号转导的蛋白质中易感的硫醇基团，因此 H₂O₂也成为一种关键的信号分子。NOX在生物膜（包括质膜）中的定位使得能够检测活细胞培养物/组织表面的NOX活性。然而，对于 H₂O₂来说，细胞外释放也可能反映细胞内 H₂O₂的产生，这种产生能够跨质膜扩散，或通过水通道蛋白通道运输。
　　在这篇protocol中，作者描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的方法，用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的  H₂O₂ 。 在这个检测体系中， H₂O₂的特异性是基于 H₂O₂与含过渡金属的血红素过氧化物（如辣根过氧化物酶HRP）在高速率常数下的高反应活性，生成的中间络合物能够催化一系列取代酚类化合物的二聚化，作者利用高香草酸（3-甲氧基-4-羟基苯乙酸，HVA）在 H₂O₂和HRP的存在下转化为强荧光二聚体的特性已成功地检测了NOX4的活性。
　　步骤节选
　　step A.  Cell-based assay
　　Day 1:  Seed cells (~50,000 cells/well) in a 24-well tissue culture plate, in complete DMEM media with 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, and 2.5 mM L-Glutamine; incubate at 37°C in a humidified incubator with 5% CO₂.
　　Day 2:  Serum-starve cells by reducing FBS concentration to 0.05% overnight (~16 h).
　　Day 3:  In some cases, stimulation with a cytokine, such as activated TGF-β1 (2 ng/mL), may be added to induce enzyme(s) that generate extracellular H₂O₂ for variable durations of time.
　　Day 3 or 4:  Assay for H₂O₂ release (see Figure 1).
　　1.Aspirate media from all wells, and wash gently with 1 mL of HBSS without phenol red.
　　2.Add 0.5 mL of assay media to each well, including three blank wells containing no cells.
　　3.Incubate at 37°C in the CO₂ incubator for 1–2 h (＂t＂ in minutes, see step #2 under ＂Data analysis＂).
　　4.At the end of the incubation period, transfer the cell-free supernatant to inpidual 13 × 100 mm glass tubes; add HBSS to the remaining cells for cell counting (to determine the number of cells/well, ＂n＂ in millions; see step #2 under ＂Data analysis＂).
　　5.Add 1.1 µL of NaOH-EDTA alkalization solution to the glass tubes containing assay media; vortex, and allow to sit for 5 min.
　　6.Transfer 300 µL of alkalized assay medium from this into a 96-well black bottom plate; measure fluorescence (relative fluorescence units, RFU) at excitation and emission wavelengths of 321 nm and 421 nm, respectively.
　　Figure 1. Schematic of workflow to determine rates of H₂O₂ release in a cell or organoid-based assay.
　　step B. Standard curve
　　1.Add 1 mL of the same assay medium (used above for cell incubation) in six 13 × 100 mm glass tubes.
　　2.Standard concentrations of H₂O₂ (0–5 µM) can be made by adding 1:1,000 dilutions to each of the tubes in step #1 above, including a blank (no H₂O₂).
　　3.The samples are vortexed, and the reaction allowed to proceed at room temperature for 5 min.
　　4.Add 2.2 µL of NaOH-EDTA solution to each 1 mL tube (in step #2), vortex again and sit for 5 min (together with cell-based samples in step #5 above, under ＂Cell-based assay＂).
　　5.Transfer 300 µL from each standard concentration to a 96-well plate, and read fluorescence as described in step #6 above (under ＂Cell-based assay＂).
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　　Bio-protocol 简介
　　Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。  Bio-protocol  期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，  Bio-protocol  已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同   Science  、  eLife  等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年  Bio-protocol  期刊已被PubMed Central，ESCI收录。