Nat。Chem。22或42，这款环化酶都行

　　本文来自微信公众号：X-MOLNews
　　副标题：催化竞争性2+2及4+2环加成反应的环化酶
　　环加成反应是两种不饱和底物之间通过协同和逐步加成形成环体系的反应（图1），可以有效实现杂环、螺环和桥环的手性构筑，其机理研究和结果预测是Woodward-Hoffmann规则和前沿轨道理论的重要成就。在过去的十年里，科学家在天然产物的生物合成中发现了催化各种类型环加成反应的酶，例如：StmD催化的[6+4]环加成反应以及PyrE3、LepI等催化的4+2环加成反应。尽管2+2环加成反应在有机合成中被广泛用于构建作为药效基团以及重要合成中间体的四元环，并且环丁烷单元也广泛存在于各种复杂的天然产物中，但目前自然界中催化2+2环加成反应的生物合成酶还尚未见诸报道。
　　近期， 中国科学院上海有机化学研究所 的 刘文 研究员（点击查看介绍）、 潘李锋 研究员（点击查看介绍）与美国 加州大学洛杉矶分校 的 K. N. Houk 教授（点击查看介绍）等人合作，在前期对吡咯吲哚霉素（Pyrroindomycin，PYR）生物合成中PyrE3和PyrI4酶促4+2环加成反应研究的基础上继续发力， 首次在吡咯孢素（Pyrrolosporin A, POL-A）的生物合成途径中发现了一个新型环加成酶PloI4（β-桶状折叠的环化酶），可以催化咯吲哚霉素中间体发生竞争性的 exo -4+2、 endo -4+2以及 exo -2+2环加成反应。 结合生物化学、结构生物学和计算化学研究结果，作者解析了该酶的催化反应机制。通过定向进化，作者对该酶的催化选择性进行了精准调控，获得了分别催化 exo -4+2、 endo -4+2及 exo -2+2环加成反应的酶变体。相关成果发表在 Nature Chemistry  上，论文的第一作者是 王洪波、邹一可、李淼 和 汤志军 。
　　图1. 协同和逐步的环加成反应。图片来源： Nat. Chem.
　　通过对吡咯孢素生产菌小单孢菌C39217-R109-7的基因组进行测序，同时以PyrI4为探针搜索到与其具有28%序列同一性的同源物PloI4，并确定吡咯孢素的生物合成基因簇。事实上，吡咯孢素与吡咯吲哚霉素的生物合成途径相似，其中吡咯孢素的苷元骨架结构也是由I型聚酮合酶（Type I polyketide synthases，PKSs）催化所形成的线性多烯骨架经外环tetronate γ-羟甲基的亚甲基化和两轮4+2环加成反应形成。不同的是由PyrI4和PloI4催化的第二个4+2环加成反应的立体选择性不同，PyrI4更有利于 exo -4+2环加成反应（图2a），而PloI4似乎具有相反的立体选择性，并催化 endo -4+2环加成反应（图2b）。另外，由于基因工程方法在小单孢菌C39217-R109-7中很难执行，从而无法获得PloI4失活的突变菌株，进而导致PloI4催化底物 3 的积累。为此，作者通过使用PyrI4的催化底物 7 （侧链较 3 短）来测试PloI4活性，结果显示 7 在50 ℃下于2 h内被完全消耗。与PyrI4不同的是，PloI4不仅产生 exo -4+2加合物 8 ，而且还产生了另外两种异构体（即 endo -4+2加合物 9 和 exo -2+2加合物 10 ），并且 8、9 和 10 的比例约为1 : 1.2 : 0.9（图2c、2d）。
　　图2. tetramate和tetronate的生物合成。图片来源： Nat. Chem.
　　根据Woodward-Hoffmann规则，协同2+2环加成是热禁阻反应。为了探究 10 的生成是否通过Woodward-Hoffmann规则所允许的协同光化学过程进行，作者在黑暗条件下进行了PloI4催化反应，结果显示产物 8、9 和 10 的HPLC图谱和比例没有发生变化（图2d），这进一步表明PloI4催化底物 7 的转化不是通过光活化，而是可能涉及逐步的热过程。为此，作者进行了密度泛函理论（DFT）计算，结果显示竞争性的4+2和2+2环加成均可以逐步进行（图3）。正如 exo -途径所示，过渡态 TS1a 经双自由基中间体 INT1a 分化，可竞争性经过渡态 TS2a 和 TS3a 形成4+2加合物 8 （29.3 kcal mol-1）和2+2加合物 10 （27.7 kcal mol-1）。尽管2+2环化在动力学上优于4+2环化，但是2+2环化产物 10 在热力学上不如产物 8 稳定，这与实验观察到的现象相一致（即将产物 10 在30 ℃放置2周会自发转化为产物 8 和底物 7 ）。或者，4+2加合物 8 可以由底物 7 经 TS1 以协同方式产生，其能量比 TS1a 略高1.4 kcal mol-1。另外，作者认为 endo -4+2加合物 9 很可能是通过逐步 endo -途径生成的，但与 10 对应的 endo -2+2加合物 13 在实验中却没有检测到。
　　图3.  exo -路径将 7 转化为 8 和 10 的计算分析。图片来源： Nat. Chem.
　　接下来，作者确定了PloI4的晶体结构，它是由两个β-折叠桶核组成的对称二聚体，两个单体彼此平行（图4a、4b），其中每个α1螺旋的功能类似于盖子，并部分占据位于对应β-桶芯中高酸性口袋的入口（图4b）。此外，PloI4突变体与产物的共结晶结构表明PloI4的底物结合口袋要比PyrI4中的更宽且更浅。如同在PyrI4中一样，底物可以定向封装在PloI4中，其中Gln75残基与Tyr95结合形成氢键二元体，同时通过与底物（即PLO中间体 3 或PYR中间体 7 ）的C3位酮羰基相互作用稳定过渡态并加速环加成反应；而突变Q75A和Y95A分别导致酶活性的完全损失和约70%的损失，证实了这两个残基对PloI4催化至关重要。
　　图4. PloI4及其变体的结构。图片来源： Nat. Chem.
　　为了研究PloI4的催化机制以及PloI4催化活性是否可以调控以进行单一环加成反应，作者突变了接近底物 7 末端∆18、19、∆20、21二烯基的残基（即Cys16、Asp46、Phe124和Ile137）（图5），生化实验结果表明Ile137在PloI4催化中起着关键作用，若将该残基变为Tyr或Phe，那么会显著抑制 endo -4+2和 exo -2+2加合物的产生（图5a、5d）。而F124的突变仅生成 endo -4+2加合物 9 ，这表明用脂族残基取代Phe选择性地阻断了竞争性 exo -4+2和 exo -2+2环加成路径。虽然I137V、C16M和D46A突变提高了 exo -2+2环加合物 10 的占比，但单残基的突变不足以将PloI4工程化为专用的 exo -2+2环化酶，为此作者进行了双突变和三突变，结果发现C16M/D46A/I137V三重突变得到的变体保留了100%的总酶活性，并对 10 的产生具有更好的区域选择性（>97:3）。此外，通过计算对接研究及复合物共晶结构分析（图4c-4f），作者认为PloI4中活性位点的空间位阻可选择性容纳某一构象而阻止其它不受欢迎构象，这在提高区域选择性和立体选择性方面起着关键作用。
　　图5. PloI4酶工程、分子建模及相关生化分析研究。图片来源： Nat. Chem.
　　总结
　　在这项研究中，研究者表明β-桶折叠环化酶PloI4能够催化竞争性的4+2和2+2环加成反应。尽管这种酶被认为是PLO-A途径中罕见的 endo -4+2环化酶，但催化PYR中间体时却失去了区域选择性和立体选择性。研究者认为PloI4的多功能性源于一个逐步机制，该机制涉及一个共同的双自由基中间体，产生热力学有利的4+2环加成产物和动力学有利的2+2环加成产物。此外，通过定向进化调控酶的区域选择性和立体选择性，获得了可分别催化 exo -4+2、 endo -4+2或 exo -2+2环加成反应的环化酶变体，为后续酶的开发及工业化应用打下了基础。
　　A cyclase that catalyses competing 2 + 2 and 4 + 2 cycloadditions
　　Hongbo Wang, Yike Zou, Miao Li, Zhijun Tang, Jiabao Wang, Zhenhua Tian, Nina Strassner, Qian Yang, Qingfei Zheng, Yujiao Guo, Wen Liu, Lifeng Pan, K. N. Houk
　　Nat. Chem .,  2023 ,  15 , 177-184, DOI: 10.1038/s41557-022-01104-x
　　导师介绍
　　刘文
　　https://www.x-mol.com/university/faculty/15568
　　潘李锋
　　https://www.x-mol.com/university/faculty/15581
　　K. N. Houk
　　https://www.x-mol.com/university/faculty/843