BioresourceTechnology利用基因工程化的嗜盐单胞菌sp。Y3从木质素中高效生产聚羟基脂肪酸酯

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　　大家好，今天推送的文章是2022年12月发表在Bioresource Technology上的＂Highly efficient polyhydroxyalkanoate production from lignin using genetically engineered Halomonas sp. Y3＂，通讯作者为乐山师范学院生命科学学院罗朝兵。
　　作者团队通过构建生产聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA)的生物合成平台，促进了更廉价、更绿色的木质素生产有价值的化学品，并为嗜极微生物转化木质素提供了新的见解。
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　　胞外异源漆酶分泌物的仿生设计与工程如图1A所示，作者团队通过胞外漆酶分泌的生物设计以促进木质素解聚。他们首先筛选了天然强启动子和RBS，结果如图1B所示，从葡萄糖和木质素培养物中提取的总蛋白均呈现一条约39 kDa的条带，包含573个蛋白质，其中56个含有可能的启动子和RBS。基因0336编码外生型羟基酶，参与外生型生物合成，这种相容的溶质广泛分布在嗜盐微生物中，以防止在高盐环境中的渗透胁迫。此外，作者团队还选择了8个不同荧光强度的基因（P0336、P0083、P0529、P0489、P3628、P2405、P0941和P1611）来驱动LSC的表达。如图1C所示，从漆酶活性来看，启动子/RBS P0336的漆酶活性最高。
　　本研究进一步开展了分泌信号肽的鉴定研究以提高漆酶的分泌。作者团队确定了基因组中可能的Tat信号肽，选择17个不同表达水平的基因的信号肽分别与漆酶蛋白融合，以测试它们的能力（图1D）。在17株重组菌株中，有9株漆酶活性显著提高，其中菌株S0886的漆酶活性最高，为9.56U/mL，而分泌肽S0158、S0230、S0489、S0737、S0784、S1766和S3823由于其对应的原生基因表达量较低而没有明显的漆酶分泌。
　　为了进一步提高漆酶的分泌，本研究进行了分泌系统的设计。本研究首先敲除了Tat系统中的关键成分TatABC以探索嗜盐单胞菌sp.Y3中天然漆酶的分泌是否由Tat转运体完成。结果表明，无论是敲除TatA、TatB、TatC还是TatABC基因都显著降低了胞外和胞质周漆酶活性，表明Tat系统在天然漆酶分泌中起主导作用。作者团队进一步过表达了TatABC，结果提高了Tat分泌系统和Y3胞外分泌漆酶的能力（图1E）。上面确定的最强的RBS分别与TatA、TatB和TatC进行整合。R0336与TatA、TatB和TatC（Y3_04）的融合导致漆酶活性比其天然RBS的过表达提高了近一倍。值得注意的是，与Y3_04相比，胞外漆酶分泌的这种增加并不显著，表明这一策略不是胞外漆酶分泌的限速步骤。
　　铜离子（Cu2+）是漆酶活性最关键的金属离子，而周质空间对革兰氏阴性细菌中高浓度的Cu2+形成天然屏障，使漆酶活性增强。如图1F所示，预培养12h后加入CuSO4，使胞外酶活性在Y3_04和Y3_05中分别达到137.02±3.07U/mL和165.54±14.87U/mL。这些酶的活力大约是在不加CuSO4的培养基中培养的酶活力的5倍。
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　　工程菌降解木质素为了实现有效的木质素降解，木质素酶（漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶）应该分泌到细胞外培养物中以便有效地与木质素结合。如图2A所示，以天然Y3和Y3_P为对照，对工程菌Y3胞外蛋白含量进行研究。结果表明，菌株Y3_05的胞外蛋白含量最高，是Y3的7.96倍，而pSEVA341单独对胞外蛋白质的分泌没有显著影响。
　　如图2B所示，菌落形成单位（Colony Forming Unit，CFU）测定表明，木质素作用7d后，Y3_05菌落数达到7.53×1010CFU/mL，通过添加ABTS，这种改进得到了进一步的加强。
　　如图2C所示，分别用普鲁士蓝（Prussian Blue，PB），31P NMR，2D HSQC NMR和GPC研究了木质素的降解情况。PB结果表明，工程菌株Y3_05对木质素的降解率显著高于对照菌株Y3，降解率为46.64±2.96%，ABTS的降解率为54.94±2.02%，分别是对照菌株的1.54倍和1.82倍。
　　如图2D所示，对木质素分子量的凝胶渗透色谱分析表明，木质素的重平均分子质量（Mw）由原始木质素（LR）降低到LY3和LY3_P。如图2E所示，通过31P NMR分析进一步证实了木质素的降解，表明工程菌Y3_05显著降低了木质素的-OH基团，其中愈创木酚基的降解率最大，其次是对羟基苯基。如图2F所示，用2D HSQC NMR研究了木质素的分子结构。如图2G所示，Y3_05的PHA滴度为302.08 mg/L，添加ABTS后滴度进一步提高到422.35 mg/L。PHA效价提高表明该工程策略对木质素生物转化为PHA具有有效地促进作用。
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　　PHA生产中的生物设计与工程 Y3基因组鉴定了木质素的整个PHA生物合成和降解途径（图3A）。有三种常见的酶参与PHA的生产，分别是phaC（PHA合成酶)、phaA（3-酮硫解酶）和phaB（乙酰乙酰-辅酶A还原酶）。通过以下方式来提高木质素生产PHA的能力：(i)敲除phaZ以减少PHA的降解；(ii)过表达phaC、phaA和phaB以促进PHA的生物合成。其次是野生型和重组盐生单胞菌。
　　对Y3进行了木质素发酵和低密度脂蛋白发酵。如图2B所示，Y3_06比野生型Y3提高了约23%的PHA效价和31%的PHA含量，达到163.15±8.08 mg/L，含量为34.93±1.60%，而DCW降低了约7%，表明该工程策略有效地提高了木质素生产PHA的能力。
　　如图3B所示，对野生型和重组嗜盐单胞菌sp.Y3进行木质素和LDCs发酵。与野生型Y3相比，Y3_06提高了约23%的PHA效价和31%的PHA含量，而DCW降低了约7%，表明该工程策略有效地提高了木质素生产PHA的能力。
　　如图3C和D所示，PA和CAT是LDCs转化的关键中间体，当以CAT为唯一碳源时，所有重组菌株的DCW和PHA产量均高于野生型菌株。
　　图3
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　　漆酶分泌模块和PHA生产模块的集成使木质素
　　和含木质素流中的PHA产量较高
　　本研究以木质素和低聚木质素为原料，获得了PHA效价较高的重组菌株Y3_08和高效解聚木质素的重组菌株Y3_05。
　　如图4A所示，作者团队首先评估了野生菌株Y3与两个功能模块共转化(Y3_co)对1 % ( w / v )碱性木质素的生长性能。与Y3相比，Y3_co的生长量有所增加。当添加1 mM ABTS时，这一增长进一步改善，而ABTS单独对嗜盐单胞菌sp.Y3的影响不显著。与细胞生长相似，漆酶活性在前4天升高，然后显著下降（图4B）。
　　添加1 mM ABTS后，Y3_co的DCW进一步增加到1192.67±58.71 mg/L，与单独添加Y3_co相比有显著提高（图4C）。作者团队试图在不额外添加ABTS的情况下对PHA发酵进行探索。对工程菌Y3_05和Y3_08进行共培养，如图4D所示，工程菌Y3_05和Y3_08的菌体滴度分别为1208.70±50.28 mg/L和349.51±6.00 mg/L。
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　　木质素非灭菌发酵生产PHA的研究 如图5A所示，本研究设计了以木质素为原料，通过两个功能模块共转化的无菌PHA发酵工艺。首先，在pH值为9.0、氯化钠浓度为60g/L的含木质素的培养液中，以180rpm的转速振荡2h以溶解木质素。然后将种子培养物添加到培养基中进行7d发酵。
　　如图5B-D所示，嗜盐单胞菌sp.Y3和工程菌在添加ABTS的情况下发酵7d仍占菌落总数的90%以上，说明非灭菌策略有效地防止了微生物污染。在非灭菌发酵条件下，嗜盐单胞菌sp.Y3的PHA产量有所提高。
　　在以木质素为唯一碳源的非灭菌培养基中，Y3_co和Y3_coA均具有显著较高的DCW和PHA产量（图5E）。当添加APL作为碳源时，Y3_05、Y3_08和Y3_co的DCW和PHA效价也显著提高（图5F）。作者团队利用非灭菌策略可以避免热灭菌对木质素的损害，从而提高PHA的产量和细胞生长。
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　　作者团队首次成功构建了嗜极生物嗜盐单胞菌sp.Y3的遗传操作流程，允许重组菌株高效分泌异源漆酶，该策略显著提高了胞外漆酶活性，有效促进了木质素降解；进一步的PHA生物合成模块构建了另一株利用木质素和LDCs高效生产PHA的重组菌，当以木质素或APL为唯一碳源时，这两株重组菌的共转化通过促进细胞生长、木质素降解和PHA的产生，产生了高效的木质素转化；通过开发非灭菌发酵工艺，进一步提高了转化率，达到了创纪录的水平。 文章信息：
　　DOI：10.1016/j.biortech.2022.128526
　　文章链接：
　　https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.128526