Biofabrication声学微分生物组装技术助力类器官构建

　　新兴声学生物组装技术以可调整方式建立细胞紧密堆积器官型构造，用于生物制造。 同时将异质细胞类型组装成具有空间定义的细胞排列异质细胞功能单元，如互补和夹层细胞结构，目前仍然是一个巨大的挑战。近日，来自 武汉大学的陈璞教授团队和美国斯坦福大学Utkan Demirci教授团队 进行了空间定义异质细胞结构尺寸和密度依赖性声学微分生物组装的相关研究。相关研究成果以＂Size- and density-dependent acoustic differential bioassembly of spatially-defined heterocellular architecture＂为题于2022年12月21日发表在《Biofabrication》上。
　　本文 为了克服以上挑战，提出一种声学微分生物组装技术， 根据细胞大小和浮力密度等固有物理特性，将不同细胞类型组装在声场的不同位置。不同的细胞类型可以在法拉第波的结点或反结点区域下进行不同组装，形成互补细胞结构，或选择性定位在结点或反结点区域下的中心或边缘区域，形成三明治式的细胞结构。 利用本技术，将人类诱导多能干细胞衍生的肝脏球状体和内皮细胞在体外组装成六边形细胞结构，模仿肝小叶中的索状和窦状结构。肝小叶模型重建了肝脏的代谢和合成功能，如白蛋白分泌和尿素生产。总之，声学微分生物组装技术可实现构建具有空间定义异细胞结构的人类相关体外类器官模型，在组织工程和再生医学中具有重大应用。
　　图1 不同PS微球的差异性生物组装
　　实验装置主要包括任意函数发生器、功率放大器、垂直振动激励器和一个装配室。 将驱动频率从15赫兹增加到100赫兹，得到一系列由法拉第波的模数对（m，n）决定的结点模式，利用数学物理模型，模拟力的势能分布以及流场流线，用来准确预测PS微球聚集区域。法拉第波在PS微球重力沉降并随机分布在组装室底部。PS微球被驱动到具有最低力势的区域，由微球的大小和密度决定。接着，PS微球组装成预定花瓣状图案。生物组装的动态过程可分为三个不同阶段，即预组装阶段、组装阶段和稳定阶段。
　　图2 基于尺寸效应的声学差异化生物组装
　　为了阐明尺寸对声学生物组装的影响，研究人员使用五种直径从50μm到1000μm的PS微球。 对于直径小于500微米的PS微球，力势分布的数值模拟表明，最低的力势存在于结点区域的下方，从而形成了结点组装模式。对于直径等于或大于500μm的PS微球，反节点区域的力势最低，导致反节点组装图案的形成。结点图案和反结点图案的覆盖率都接近50%和20%，表明不同直径的PS微球都准确地聚集在力势最低的相应位置。 通过引入两种具有完整最低力势分布的PS微球，得到了互补的组装模式。尺寸较小的微球排列在尺寸较大的微球周围，形成了三明治图案。在夹层图案中，1000微米的PS微球和500微米的PS微球分别位于中心和边缘区域，具有较大尺寸的PS微球将优先安排在节点或反节点区域下面的中心区域，因为有较大的力势差异。构建块根据其尺寸不同而形成互补和夹层模式现象定义为 ＂尺寸效应＂。
　　图3 基于密度效应的声学差异化生物组装
　　接着使用直径为100微米密度不同的微球，研究密度对声学生物组装的影响。结果发现，不同密度的微球都被组装在结点区域下面。同时组装两种密度不同的PS微球，密度较高的PS微球组装在结点区域的中心区域，而密度较低的微球排列在结点区域的边缘，从而产生了三明治图案。 对PS微球分布的定量分析也表明，密度较低的微球被安排在高密度微球周围。与密度较低的PS微球相比，密度较高的PS微球由于受力电位差较大，会优先排列在结点区下面的中心区域。构建块根据其密度不同组装成夹层图案的现象被定义为 ＂密度效应＂。
　　图4 利用声学差分生物组装构建肝小叶样肝脏模型
　　在肝脏中，肝小叶是基本的功能单元，由径向排列的肝索和围绕中央静脉的肝窦组成，形成六角形异细胞结构。为构建类似肝小叶的肝脏模型，研究人员将肝脏球状体和HUVEC包裹的微凝胶不同程度地组装成花瓣状的异细胞结构，并在体外进行培养 。通过细胞活力测试评估基于法拉第波差分生物组装技术的生物相容性。结果显示生物组装前后的细胞活力没有明显的差异，表明细胞活力不受生物组装过程和后续培养过程的影响。研究人员首先将肝脏球状体或HUVEC包裹的微凝胶分别组装成花瓣状细胞结构，其中肝脏球状体分布在结节区域下方，而HUVEC包裹的微凝胶组装在反结节区域的下方。将肝脏球状体和HUVEC包裹的微凝胶不同程度地组装成互补的花瓣状细胞结构，不仅模仿了原生肝小叶结构，还可使肝实质细胞和支持细胞之间直接接触。
　　图5 评估肝小叶样肝脏模型的功能
　　组装好的肝小叶状肝脏模型肝脏特异性功能研究发现：模型具有肝脏的特定功能，包括糖原储存和脂质积累。在第7天对肝小叶样肝脏模型进行免疫荧光分析。结果表明，模型白蛋白和HNF-4α均为阳性。 在非组装模型中，两种类型含细胞构件随机排列，一些细胞对白蛋白
　　和HNF-4α阳性，更多非风湿性细胞产生并存在于模型外表达波形蛋白。这些未组装模型会逐渐失去肝脏功能。为了进一步定量评估肝小叶样肝脏模型肝脏代谢和合成功能，分析白蛋白的分泌和尿素产生，组装好的肝小叶样肝脏模型中白蛋白和尿素水平相对高于非组装模型。白蛋白分泌和尿素产生在第6天达到最高水平，表明肝小叶类肝脏模型可以重建肝脏关键的特定功能。
　　总之，本文进行了空间定义异质细胞结构尺寸和密度依赖性声学微分生物组装的相关研究。生物制造主要任务是制造由异细胞结构组成的组织和器官特定功能单元。声学差分生物组装技术可解决长期存在的挑战。该技术采用法拉第波和含有细胞构件之间大小和浮力密度相关的相互作用，在空间确定细胞位置。基于这一原则，开发了两种类型差分组装策略：（1）在法拉第波的结点和反结点下对细胞块进行差分组装，形成互补的细胞结构；（2）在法拉第波的结点或反结点下，在中心和边缘对细胞块进行差分组装，形成夹层细胞结构。接着将hiPSC衍生的肝脏球状体和内皮细胞不同程度组装起来，形成互补的异型细胞结构，模仿肝小叶的原始结构。基于法拉第波的新型差分生物组装技术将成为生物打印的重要替代工具，用于构建具有空间定义异细胞结构的人类相关人体类器官模型，促进基础医学研究、药物筛选和再生医学发展。
　　文章来源：
　　https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca79c
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