稳定细胞株构建11个注意事项帮你搞定细胞转染

　　稳定细胞株构建的第一个步骤就是细胞转染，这项实验的原理大家都清楚，但是为什么一上手就会出现多种问题，在实验第一步就栽了跟头呢？
　　是细胞转染方法不对头？还是实验过程中的某个因素影响了转染效率？了解本文这11个注意事项，让你的细胞转染实验顺利通关！
　　所谓转染，是指在真核细胞里导入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常选用的转染方法包括物理介导法（如电穿孔法、显微注射和基因枪等）、化学介导法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质介导法）、生物介导法（如原生质体转染、病毒介导转染等）。上述方法中，实验室最常用的方法当属是脂质体转染（质粒转染） 。
　　质粒转染操作简单，分为瞬时转染和稳定转染。针对不同属性细胞系，选择转让方式时要做足功课，千万不要图方便，否则转染效率简直崩溃。影响转染效率的因素有很多，比如准备不充分、转染条件不佳；再比如细胞株本身的特性和活性、细胞污染，转染的DNA/RNA的质量，转染方法，转染试剂的选择等，小编总结了这11个注意事项，一起来学习吧！
　　01血清条件下的细胞转染
　　转染可以使用血清，前提是DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，否则会降低转染效率（血清会影响复合物的形成）。
　　转染用的培养液可以含血清也可以不加，如加血清则应在DNA-阳离子脂质体复合物形成后加入，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
　　对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用专用转染试剂。条件允许情况下，可以用无血清培养基代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
　　02培养基中的抗生素（PS）
　　抗生素（如青霉素、链霉素等）是影响转染的培养基添加物。由于阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使得对真核细胞无毒的抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率降低。因此，应避免在转染前细胞铺板时和在转染培养基中使用抗生素，在转染前也不必润洗细胞。
　　03细胞状态
　　众所周知，细胞的生长状态影响实验结果，原代细胞和传代次数多的细胞都不是最佳选择，处于对数生长期的细胞生长状态最好，最适合转染。有文献研究传代不要超过17代，细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，传代过多细胞形态都会发生变化。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
　　04细胞铺板密度
　　用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2-4×106细胞/ml，确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。细胞的融合度必须要达到90%才能做。
　　05启动子的选择
　　获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV(劳斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞)中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
　　06DNA量
　　高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。产物表达，48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。
　　07瞬时/稳定转染表达
　　稳定基因表达符合长期生产需求。整个实验操作流程提供长期稳定及规模可调的蛋白生产。与稳定基因表达相比，瞬时表达（TGE）主要适用于短期内制备重组蛋白，普健生物的瞬时表达使用悬浮细胞，能够完成mL到100L的体积的蛋白表达，一般在10天内即可快速转染，无需质粒DNA的遗传性选择。
　　08转染效率监测
　　基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。
　　可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用简单的非同位素方法检测b-gal的表达以测定转染效率和活性。pCMV SPORT- bgal质粒包含CMV启动子调控下的LacZ基因，转染入真核细胞内后可以直接表达bgal。结合简单的检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。
　　09稳定转染细胞系的筛选
　　用载体中所含的选择标志进行筛选是建立稳定转染细胞系最常用的方法。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。
　　10蛋白表达和培养基的选择
　　哺乳动物细胞系合成可溶的、翻译后修饰的蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白。普健生物使用细胞系包括CHO，HEK293,CHO-S,CHO-K1等常用细胞系。普健生物提供克隆的HEK293，CHO-S，DG44和CHO-K1细胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白，使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。
　　11转染效率的验证
　　最有效的验证方式必须是qPCR验证。
　　荧光观察，使用病毒转染，明白自己病毒的情况，是荧光标记（一般是GFP）还是非荧光标记。质粒转染，可以在载体上添加荧光标记，帮助自己通过荧光观察转染效率。但是荧光并不能完全证明转染效率，还是通过核酸验证最为准确。