视频大赛优秀作品昆虫显微注射方法

　　显微注射方法是在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器，控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是昆虫基因功能研究的有力手段，作为一种新型的、特异性强、对环境相对友好且能带来经济效益的技术，目前逐渐成为发现和验证防控害虫基因的研究方法之一。目前常用的RNA干扰呈递方式有注射法和饲喂法，一般情况下，注射法干扰效率高，实验结果稳定。
　　稻飞虱是亚洲许多地区的主要水稻害虫 。稻飞虱体积小，需要在体视镜下进行操作，因此对实验操作者的手眼配合能力和注射熟练程度有一定的要求。本视频以小型昆虫稻飞虱为例，应用显微注射方法，将dsRNA递送至昆虫体腔，以达到基因沉默的目的 。该方法在昆虫基因研究中应用广泛，不过微量注射对昆虫虫体本身有一定的损伤，需要先使用二氧化碳将试虫麻醉，然后选择昆虫体壁较薄的节间膜位置进行注射。注射部位通常选择在前胸和中胸之间，如图1所示 。详细的操作方法和注意事项，请访问下方的视频链接。
　　图1. 稻飞虱若虫注射示意图。Ⅰ：前胸和中胸连接处；Ⅱ：腹部第二节和第三节之间位置；Ⅲ：腹部第三节和第四节之间位置
　　一、样品信息与耗材仪器
　　1. 样品信息
　　稻飞虱若虫
　　2. 试剂和耗材
　　50mL离心管、WPI玻璃毛细管、眼科显微剪刀、装有液体石蜡的注射器、2%琼脂板、0号毛笔、装有新鲜水稻苗的一次性透明塑料杯WPI注射针、吸虫器、水稻苗、显微镜、注射器、二氧化碳气瓶（麻醉）
　　3. 仪器和软件
　　显微操作仪器：Nanoject 4 micoinjection device (MicroSyringe Pump Controller; World Precision Instruments, USA)
　　二、实验操作
　　昆虫显微注射方法——以稻飞虱为例
　　该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获二等奖，欢迎点击链接查看原视频：昆虫显微注射方法——以稻飞虱为例—BIO-101
　　1. 剪针
　　将拉好的毛细玻璃管柔软尖端剪掉，保留合适硬度的针尖。装液体石蜡，用注射器将液体石蜡推进、装满玻璃针管。装针，首先旋下泵头套，将玻璃针的尾端从泵头套前端装入，然后，将3个垫圈按照＂黑白黑＂的方式，依次将大孔径黑垫圈套进玻璃针尾部，小孔径黑色垫圈套进注射泵钢针，白色垫圈小孔径朝向钢针，套在钢针上。最后，将玻璃针尾部朝向钢针，将钢针插入玻璃针，用纸巾吸走溢出的液体石蜡。缓慢推进泵头套和玻璃针，将泵头套连同玻璃针安装在注射泵上。
　　2. 仪器设置
　　打开显微注射泵，进行系统设置。选择远程控制，即使用脚踏板控制。选择钢针方向，设置为推出模式。单击脚踏板，注射泵将钢针排出，推出大约1/3液体石蜡。
　　3. 吸取dsRNA
　　如dsRNA等需要注射进入试虫体内的试剂。吸入体积约是排出液体石蜡的体积。吸入的液体与液体石蜡有明显分层。
　　4. 麻醉试虫
　　使用二氧化碳熏虫，约30s。
　　5. 显微注射
　　使用体视镜，2倍放大。将玻璃针尖插入试虫胸部前胸和中胸或者中胸和后胸的中间位置，单击脚踏板，完成注射。注射完成后，用0号毛笔将试虫推离玻璃针，放置在琼脂板的另一边。随后，通过移动琼脂板，在显微镜视野中进行下一头试虫的注射。直至完成琼脂板上所有试虫的注射，用吸虫器将试虫转移进50mL离心管，等待试虫苏醒。
　　6. 卸针
　　完成注射后，旋高注射泵，移走琼脂板。缓慢拧下泵头套，拿下玻璃针。用玻璃针尾部挤推出3个垫圈，并归位。将使用完的玻璃针丢弃在玻璃垃圾桶中。然后，将泵头套复位。最后，收回钢针。
　　7. 关机
　　关闭体视镜光源，关闭显微操作泵操作器。关闭二氧化碳气瓶，先关闭主阀，放出气管中剩余气体，气压为0后，关闭分阀，关闭操作阀。
　　8. 转移试虫
　　试虫苏醒后，将试虫转移至新鲜水稻苗上饲养。以备下一步实验。完成显微注射。
　　三、注意事项
　　1.每次使用二氧化碳麻醉稻飞虱若虫数量不宜过多，15-20头为宜。
　　2.稻飞虱若虫接受二氧化碳麻醉不宜超过2次。
　　四、作者单位与课题组简介
　　单位简介
　　南京农业大学植物保护学院成立于2000年，肇始于1902年三江师范学堂的病理学，从金陵大学1916年设立的植病组、昆虫组以及国立东南大学1921年创立的中国第一个植物病虫害学系发展而来，是我国近代植物病理学、昆虫学及植物检疫事业的发祥地之一。
　　课题组简介
　　杀虫剂药理与神经毒理学实验室成立于2006年，是以昆虫神经系统中的杀虫剂靶标为主要研究对象，以靶标与杀虫剂之间的相互作用为主要研究内容，在探索靶标药理学特性的基础上，建立靶标与杀虫剂互作模型，作为害虫抗药性机理研究、杀虫剂作用机理和选择性机理研究技术平台，为高效高选择性新型杀虫剂开发提供生物学支撑。
　　五、参考文献
　　1. Liu, Z., Williamson, M.S., Lansdell, S.J., Denholm, I., Han, Z., Millar, N.S., 2005. A nicotinic acetylcholine receptor mutation conferring target-site resistance to imidacloprid in Nilaparvata lugens (brown planthopper). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 8420e8425.
　　2. Liu, S.H., Ding, Z.P., Zhang, C.W., Yang, B.J., and Liu, Z.W. (2010). Gene knockdown by intro-thoracic injection of double-stranded RNA in the brown planthopper, Nilaparvata lugens. Insect Biochem Molec 40, 666-671.
　　Bio-protocol 简介
　　Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。  Bio-protocol  期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，  Bio-protocol  已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同  Science  、  eLife  等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年  Bio-protocol  期刊已被PubMed Central，ESCI收录。