Angew。Chem。Int。Ed。工程化P450BM3用于不饱和烃的直接硝化

　　今天推送的文章是2023年1月发表在Angewandte chemie International Edition上的＂Engineering Cytochrome P450BM3 Enzymes for Direct Nitration of Unsaturated Hydrocarbons＂，通讯作者是来自中国科学院青岛生物能源与过程研究所的丛志奇研究员。
　　生物催化硝化是一种环境友好的方法，需要较温和的反应条件，才可能高度选择性地生产硝基化合物。天然硝化酶的底物范围狭窄，例如，N-加氧酶只能将氨基官能团转化为硝基。同样，在细菌、真菌、植物和动物中发现的许多过氧化物酶可以有效地催化芳香化合物的直接硝化，但它们的底物仅限于酚类和芳香胺。细胞色素P450家族的多功能加氧酶（TxtE），其可以使用O2和NO作为共底物催化其特定底物L-色氨酸的硝化(图1B)。通过基因组挖掘或设计具有硝化功能的同工酶来实现硝化的新型酶的应用，可能为硝基化合物合成的传统方法提供一种可持续的替代方法。
　　之前的研究先开发了双功能小分子(DFSM)促进的P450-H2O2系统，其中合理设计的 DFSM与长链脂肪酸羟化酶P450BM3结合以促进H2O2活化(图1A)。该体系表现出对非天然底物的过氧化活性，如环氧化、亚砜化和羟基化。最近，还发现了它的过氧化物酶活性，并通过氧化还原敏感残基的组合定点突变，增强了它对各种经典单电子氧化底物的作用。受过氧化物酶催化的芳香族硝化的启发，作者假设DFSM促进的P450过氧化物酶系统也可以使用亚硝酸盐作为硝化剂催化类似的反应。P450BM3大而深的活性口袋也可以提供允许特异性和选择性的底物结合位点，因此比天然过氧化物酶更有优势。本文主要研究了DFSM辅助的工程化P450BM3酶对不饱和烃(包括酚类，苯胺和苯乙烯)的直接硝化作用(图1C)。
　　首先作者通过筛选P450BM3突变体库，研究了愈创木酚在H2O2和NaNO2存在下的氧化。在不存在DFSM（IM-C6-Phe）的情况下进行反应时，未检测到硝化产物。在IM-C6-Phe存在时，P450BM3 87位的大多数单点突变产生愈创木酚的邻位和对位硝化产物。通过改变其氧化还原敏感残基，提高其硝化活性(图2A,B)。例如，与最佳单点突变F87A相比，三点突变 F87A/Y160I/M237I导致 催化总周转数(TTN) 提高1.4倍(图2D)。与F87A突变体相比，氧化还原敏感残基的突变导致P450BM3的羟基化活性降低，这有利于硝化反应。然而仍然观察到大量的羟基化产物。
　　在相同的条件下，使用 F87A 或带有额外氧化还原敏感残基突变的突变体对苯酚进行反应，只产生少量的硝化产物 。在 分析P450活性位点结构和催化机制的基础上，作者假设在87位引入一个庞大的残基可以阻止苯酚进入活性位点，从而阻止竞争性羟基化产物的产生。在IM-C6-Phe存在的情况下，突变体F87L确实选择性地产生邻硝基酚和对硝基酚，TTN提高了3倍，同时没有检测到任何芳香烃羟基化产物。
　　接下来，对氧化还原敏感残基进行突变以进一步提高突变体F87L的硝化活性。4个双突变体中只有F87L/Y160I和F87L/Y198I的TTN较F87L略有提高(1.1-1.2倍)。然后，作者试图通过将F87L与位于活性中心附近的A82、V78、L181、A184、L188、I263、E267和A328进行组合突变来微调活性位点附近的构象。对于每个残基引入2-3个突变，构建一个小型文库。在双突变体F87L/A82T引入第三个突变体L181M后，苯酚硝化活性进一步提高 (图2D)。这一结果表明，采用三密码子饱和突变(TCSM)和迭代饱和突变(ISM)等半合理设计技术可以进一步提高硝化产物的区域选择性。
　　通过筛选含有愈创木酚和苯酚硝化突变体的突变文库，研究了取代苯酚的硝化反应。大多数含有F87L突变的突变体比含有氧化还原敏感残基的变体具有更高的硝化活性。电负性最强的对氟苯酚的硝化TTN最高(F87L/A82T/L181M可达1647TTN)。这是第一个使用亚硝酸盐作为硝化试剂的工程P450突变体对酚类化合物进行直接硝化的报道。为了进一步扩大底物范围，作者筛选了F87的饱和单突变文库，并且在IM-C6-Phe存在下检测到三种硝化产物，苯甲酰硝基甲烷(20a)，2-硝基-1-苯乙烷-1-醇(20b)和β-硝基苯乙烯(20c)。与苯酚硝化相似，较大的F87L突变体产生较高的硝化产物催化周转数，只有微量的苯乙烯氧化物。双突变体F87L/A82C被鉴定为表现最好的突变体，所有三种硝化产物的总TTN为309。DFSM促进的F87L/A82C系统显示出总TTNs的显著改善，表明开发的P450系统对苯乙烯硝化有效的催化作用。
　　其次，研究了苯乙烯衍生物的硝化反应。在对单突变库进行筛选后，作者发现F87K比F87L更有利于4-氯苯乙烯的硝化。以F87K为基础构建了一系列双突变体，进一步提高了对4-氯苯乙烯的硝化活性。此外，具有给电子基团的苯乙烯衍生物比其他底物具有更高的硝化活性。
　　作者进一步分析了F87A（1.68Å）和F87L（2.07Å）突变体的晶体结构(图3)，这两种结构都具有典型的P450血红素结构域，中心血红素靠近活性位点，连接到NH2OH分子。在前端构象中，NH2OH分子与咪唑基末端氮原子的距离在3 Å左右，说明DFSM的咪唑基可能是H2O2活化的一般酸碱催化剂(图3B,E)。最重要的是，尽管F87A和F87L的整体结构非常相似，但两种结构中苯酚底物的位置不同 (图3A,D)，从而说明了F87A和F87L突变体在反应化学选择性上的差异。因此，除了DFSM中苯酚苯环与咪唑之间的π-π相互作用外，苯酚还通过羟基与E267之间的H键和H2O介导的H键网络与T268相互作用(图3B,E)。F87A和F87L的结构叠加进一步揭示了苯酚底物在两种结构中的位置不同。由于亮氨酸残基的空间位阻，苯酚在F87L中比在F87A中离血红素中心更远(图3G)。这一现象也解释了上述反应结果，即F87L和其他在87位具有较大侧链的突变体很少产生芳香族羟基化或环氧化产物。
　　最后，作者通过自由基捕获和控制实验揭示了直接硝化反应机理。推测DFSM促进的P450-H2O2系统的芳香硝化遵循过氧化物酶的经典模式（图4）。本研究首次报道了P450催化亚硝酸盐和H2O2直接硝化芳香族化合物和芳基末端烯烃的反应。该蛋白质工程方法基于立体效应的引入，提供了开发P450硝化酶的新见解，为生物催化硝化开辟了新的途径。
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　　DOI：10.1002/anie.202217678