科学家将谷物醇溶蛋白支架用于干细胞培养，为生产细胞肉提供思路

　　近日，新加坡国立大学食品科学系教授黄德建团队通过在蛋白支架上接种和培养猪肌肉干细胞， 成功制备一种细胞培养猪肉片原型，为生产细胞培养肉提供了新思路。
　　具体来说，他们首次以谷物醇溶蛋白（玉米、大麦和黑麦蛋白）为原料，制备出具有合适流变性质的纯植物基墨水，并通过高精度的静电场电流体喷射 3D 打印技术（EHDP，Electrohydrodynamic print），制造了微结构可控的谷物醇溶蛋白纤维支架。
　　（来源：Advanced Materials）
　　细胞培养肉离大众餐桌越来越近
　　当前，随着细胞培养肉技术的发展，其在规模化生产与成本控制方面也日趋成熟，细胞培养肉产品离大众的餐桌也越来越近。
　　2020 年，全球首款培养肉产品在新加坡获批上市。2021 年，细胞培养肉公司 Future Meat 在以色列建成了世界第一条细胞培养肉生产线，日产可达 500 公斤。
　　而在最近，荷兰公司 Meatable 与新加坡公司 Esco Aster 合作研发出含细胞培养肉的猪肉水饺，预期于 2024 年投产。由此可见，全球细胞培养肉产业正在迅速发展。
　　细胞培养肉，是一种颠覆性的肉类生产新技术，其根据动物肌肉生长修复机理，利用干细胞作为原料、结合组织工程等技术，通过在体外大规模培养肌肉与脂肪细胞形成可食用的肉类。可以说，细胞培养肉是未来人造肉的主要研究发展方向。
　　其制造主要包括如下步骤：
　　首先，获取可诱导产生肌源性细胞的干细胞作为种子细胞，通过生物反应器扩大培养，实现种子细胞的大规模增殖；
　　然后，利用分化模具比如 3D 组织工程支架，诱导种子细胞大规模分化成为肌肉组织；
　　最后，利用食品加工技术制作味道和营养俱佳的肉类食品。
　　由此可见，细胞培养肉是一种高度跨学科、技术密集型的未来肉类生产方式。2013，荷兰马斯特里赫特大学血管生理学教授马克·珀斯特（Mark Post）研发了全球第一块含人造牛肉的汉堡包，并在英国伦敦举办了试吃大会，首次证明了培养肉概念的可行性。然而，其成本造价高达 32 万美元。
　　随着人造肉概念的流行和市场的推动，在干细胞的获取、无血清培养基的开发、生物反应器扩增等方面，细胞培养肉技术均取得了突破性进展。目前，细胞培养肉的成本已下降至 17 美元/公斤。
　　将高精度 3D 打印支架制造技术，引入细胞培养肉制作过程
　　而培养肉的最终目标：是在体外培养一块与真实动物肌肉组织具有相似结构的人造肉。因此，需要探索将肌肉干细胞分化成肌肉组织的方法。
　　3D 组织工程支架，是一类与细胞外基质具有相似组成和结构的细胞生长载体，可诱导细胞在体外生长和分化成特定的组织器官，此前已被广泛用于生物医学的研究中。
　　然而，目前此类组织工程支架主要由合成型生物高分子材料、以及动物来源的天然高分子材料比如胶原蛋白等构成。其成本比较高昂，因此无法满足大规模生产细胞培养肉的需要。
　　而可用于工业化的细胞培养肉的支架材料，应该满足以下条件：（1）可食用和可消化的；（2）可以大规模低成本地获取；（3）具有和肉类组织相似的强度和口感；（4）具有良好的细胞亲和性；（5）可以支持肌肉组织细胞的黏附和增殖。
　　这说明，通过借鉴组织工程支架研究积累的成果，可以研发出用于细胞培养肉的关键技术。 静电场电流体喷射 3D 打印技术（EHDP）是近年来兴起的一种 3D 支架制造技术，能够制备微结构可控的超细纤维支架。
　　它的纤维尺寸与细胞大小相似，可以高度还原细胞外基质环境，从而控制细胞的生长行为，因而被广泛用于 3D 细胞培养与组织工程等领域。
　　用 EHDP 技术制作的支架，还具备高孔隙率和可控的纤维结构等特性，特别适用于细胞培养肉。
　　然而，EHDP 技术对打印墨水的性质有很高的要求，目前可用的墨水材料十分有限且多为合成高分子材料，无法满足制作细胞培养肉的基本需求。因此，在制造可食用级的 3D 打印支架上，此前依旧缺乏食品级的墨水材料。
　　而此项成果的创新之处在于：研究团队提出使用一类谷物醇溶蛋白，来作为细胞培养肉的可食用生物材料和墨水材料。谷物醇溶蛋白作为食品工业的主要副产物之一，来源广泛且产量巨大，长期以来被用作动物饲料。
　　而近期的研究发现，此类蛋白具有特殊的溶解特性和生物亲和性，是一类很有潜力的植物基可食用生物材料。
　　使用谷物醇溶蛋白用于细胞培养肉的制作不仅能变废为宝，还能降低其生产成本，为细胞培养肉的制作提供一类新型植物源可食用生物材料。
　　此外，课题组通过配制纯植物蛋白墨水材料，成功将高精度 3D 打印支架制造技术引入培养肉的制作，提供了一类新型的可食用 3D 支架系统。
　　图 | 3D 打印的可食用谷物蛋白支架即造肉猪肉片示意图（来源：课题组）
　　近日，相关论文以《用于细胞培养肉的 3D 打印醇溶蛋白支架》（3D-Printed Prolamin Scaffolds for Cell-based Meat Culture）为题发表在   Advanced Materials  上。
　　图 | 相关论文（来源：Advanced Materials）
　　新加坡国立大学食品科学与工程系博士生苏凌珊为第一作者，新加坡国立大学苏州研究院食品科技中心副研究员敬霖志博士为共同一作和共同通讯，新加坡国立大学食品科学系黄德建教授担任通讯作者。该工作得到了新加坡国立大学苏州研究院大健康食品科技卓越研究中心项目的支持。
　　图 | 敬霖志（来源：敬霖志）
　　可用于培养具有一定组织形态的培养肉
　　据悉，当前的细胞培养肉产品主要通过生物反应器的大规模扩增，去获得肌肉干细胞，再经过一定的成型技术加工成为肉饼或肉丸等产品。这一技术的核心在于大规模、低成本地获取肌肉干细胞。
　　但是，利用组织工程技术制作具有一定组织形态的培养肉如牛排等，仍然颇具挑战。其中，开发新型的可食用支架系统，是目前培养肉研究的一个关键难题。
　　而本研究提供了一种纯植物蛋白基的多孔纤维支架，可用于培养具有一定组织形态的培养肉。
　　未来，该团队将通过对支架微结构与功能的优化、细胞接种技术的提升、以及产后食品加工技术等几个方面为抓手，制造出与真实肉类组织例如＂五花肉＂等高度相似的人造肉产品。
　　同时，他们也会与企业密切合作，早日把所培养的人造肉端上中国人的餐桌。此外，由于 3D 打印技术的可定制性和植物蛋白结构的多样性，此类支架也可用于其它动物来源组织细胞的培养，从而制造不同的培养肉产品。
　　最后，对于生物医用组织工程支架材料来说，这款植物蛋白支架也是很好的补充。通过使用具有细胞亲和性的植物蛋白材料，可以调整目前合成高分子材料和动物源性蛋白支架材料的机械性能、生物可降解性和细胞亲和性等，同时降低制造成本，提高生物稳定性，从而为组织工程材料的拓展提供新的思路。
　　回国加入苏研院，继续从事纯植物蛋白支架的研究
　　此次课题的研究要从敬霖志的博士研究课题说起。2016 年，在机缘巧合之下他加入了黄德建教授的课题组，成为一名博士研究生。彼时，该团队的研究方向是天然产物的提取、以及生物活性的表征和小分子生物探针的合成。
　　考虑到敬霖志的专业与研究背景（本科为材料科学与工程，硕士为有机化学），导师决定让他开展一个新的研究方向，即基于植物蛋白的 3D 打印墨水材料的开发。
　　通过与新国大机械工程系孙捷博士（本文的合作者，现为西交利物浦大学教授）合作，敬霖志首次接触到了电流体喷射 3D 打印技术，并由此开始了博士研究课题。
　　作为一个新兴的技术，借助电流体喷射 3D 打印可以制造具有可控微结构超细纤维支架，目前主要用于 3D 细胞培养和组织工程的研究中。
　　在博士课题的研究中，敬霖志发现玉米醇溶蛋白具有特殊的溶解特性和良好的生物相容性，借此并成功配制了用于电流体喷射 3D 打印技术的玉米醇溶蛋白/聚己内酯复合材料墨水，以拓展其在生物医学工程中的应用。
　　（来源：Advanced Materials）
　　2020 年，敬霖志参加了母校新国大的研究生创业创新计划，该项目旨在激发研究人员的创业热情，将科研成果进行商业转化、孵化创业公司。
　　在此项目中，他关注到细胞培养肉技术的发展和众多的培养肉初创公司，萌生了将玉米醇溶蛋白和电流体喷射 3D 打印技术用于培养肉制作的想法，并在导师的支持下，提交了一份关于此想法的项目申请书。
　　尽管因为技术成熟性和可放大性方面的原因最终没有得到批准，但通过参加此项目进一步拓宽了他的视野，加深了他对产业驱动研究的兴趣。
　　2021 年，敬霖志加入了新加坡国立大学苏州研究院（简称苏研院）大健康与食品工程卓越研究中心，继续从事关于纯植物蛋白支架的研究。
　　正所谓＂量变引起质变＂，有了博士期间在静电场电流体喷射 3D 打印技术长期积累，再通过筛选不同的植物蛋白、优化墨水性质和打印参数，经过一年多的努力，他和团队终于成功打印了具有稳定微观结构的纯谷物蛋白纤维支架。
　　（来源：Advanced Materials）
　　紧接着他与新国大博士生苏凌珊一起攻克了人造肉培养的难关。为了获得细胞培养肉模型，在获得可食用蛋白支架后，需要将动物骨骼肌细胞培养在支架上。
　　然而，当时细胞培养肉的相关文献多为综述，实验研究相对较少。通过参考肌肉组织工程领域的报道，在研究初期他们以小鼠成肌细胞（C2C12）为实验模型，探索骨骼肌干细胞在体外 3D 培养的条件。
　　为了更好地满足大众对人造肉的需求，课题组将研究目标转移至猪来源的骨骼肌干细胞。
　　但是很快他们就发现，这类干细胞很难在体外进行 3D 培养，因为要在体外大规模增殖的同时，维持一定的细胞干性（用于后期细胞分化为成熟肌肉组织）。
　　经过不断的尝试和努力， 他们最终实现了猪骨骼肌卫星细胞在蛋白支架上的黏附、增殖和分化，并于 2022 年初成功培养出第一块猪肉片模型。
　　一年多来，研究团队也在不断地发现并解决问题。考虑到这个课题的前瞻性，实验过程中他们探索并改装了设备。
　　以力学测试为例，他们发现醇溶蛋白支架一接触水就会溶胀变软，使得实验操作变得困难。而为了测得溶胀支架的力学性质，需要将支架平整地放置在测试仪器的夹具上。
　　为此，他们先将支架固定，通过加湿器制造恒湿微环境，保障在力学测试过程中支架可以保持溶胀状态。
　　在解决这一问题后，他们发现溶胀后的支架韧性更好、硬度更低，更接近体内细胞外基质（支撑细胞生长的成分）的性质，因而适合骨骼肌细胞的生长。＂这也让我们体会到了‘山重水复疑无路，柳暗花明又一村’的意境。＂敬霖志说。
　　基于此次成果，他们将尝试将培养不同的组织细胞，比如把脂肪干细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等接种在打印的蛋白支架上，实现不同组织细胞的共培养，进一步提升培养肉的风味和口感。
　　最后，为进一步提高细胞分化效率和细胞密度，其将尝试在生物反应中对接种在支架上的细胞进行动态培养，提高其生长分化效率，为产业化生产奠定基础。
　　参考资料：
　　1.Su, L., Jing, L., Zeng, X., Chen, T., Liu, H., Kong, Y., ... & Huang, D. (2022). 3D‐Printed prolamin scaffolds for cell‐based meat culture.  Advanced Materials , 2207397.