实验方案系列从小鼠中获取成熟小胶质细胞的分步操作

　　撰文︱张国新
　　责辑︱王思珍，崔文瑞，方以一
　　编辑︱王思珍，崔文瑞
　　目前，小胶质细胞系、原代胎鼠/新生鼠小胶质细胞和急性分离的成年鼠小胶质细胞用于相关的体外研究。 然而，产量低、表型不成熟、需要较多数量的实验动物是目前研究小胶质细胞的主要障碍。因此，需要开发了一种可储存、可扩增、且接近成年成熟小胶质细胞的新方法。
　　在小鼠胚胎期（Embryo days，E）8.5-16.5天（E8.5-16.5），卵黄囊（yolk sac）中的小胶质前体细胞通过头部神经上皮层迁移进入脑实质，并分化为独特的分支状小胶质细胞。E13.5小鼠神经上皮层（neuroepithelial layer，NEL）由小胶质始祖细胞和神经上皮细胞组成，可以对这个时间段的NEL进行解剖、繁殖扩增，并可以长期储存。
　　基于上述小胶质细胞的发育成熟过程，韩国抱川中文医科大学（现名CHA医科大学）Min-Jung You博士和Min-Soo Kwo博士解剖了E13.5小鼠胚胎并获得了神经上皮层（NEL）（图1） 。NEL培养过程中，小胶质前体细胞逐渐成熟（图1） 。通过磁性细胞分选系统，成熟的CD11b阳性的小胶质细胞（MG）被很容易地从培养的NEL中分离出来（简称NEL-MG）（图1） 。与新生鼠小胶质细胞和体外小胶质细胞系相比，此种方法可以获得更高产量、更接近成年脑内成熟的小胶质细胞（NEL-MG）。且这种新方法仅需要少量实验动物。 相关工作以＂A Step-by-step Protocol for Obtaining Mature Microglia from Mice＂ 为题发表于 Bio-Protocol 。本实验方案具体介绍如下：
　　图1. 流程总结   一、材料与试剂
　　动物
　　精准怀孕（13d；TP13）的C57BL/6小鼠（雌性）
　　培养器皿
　　1.EP管（Axygen，目录号：MCT-150-C）
　　2.15 mL离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
　　3.100 mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150466）
　　4.T-25培养瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：156367）
　　5.Hanks’平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：14170-112）
　　6.75%无水乙醇（Dajung Chemicals & Metals，，目录号: 4023-2304）
　　7.2.5%胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号: 15090-046）
　　8. 多聚右旋赖氨酸（Poly-D-lysine，PDL）（Sigma-Aldrich，目录号：P7280-5MG）
　　9. Dulbecco’s改良Eagle培养液（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：11995-065)
　　10.青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15140-122）
　　11.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：16000-044）
　　12. GlutaMAXTM（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：35050061）
　　13. Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：14190-144）
　　14.台盼蓝染料（0.4%）（Thermo Fisher Scintific，GibcoTM，目录编号：15250-061）
　　15.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650-5X5ML）
　　16.牛血清白蛋白组分V（BSA）（Merck，目录号：10735086001）
　　17. CD11b（小胶质细胞）微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-634）
　　18. MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
　　19.培养基（500 mL）（见配方）
　　20. 70%乙醇（100mL）（见配方）
　　21. 0.25%胰蛋白酶（10mL）（见配方）
　　22. PB缓冲液（50mL）（参见配方） 二、实验设备
　　1.光学显微镜（Olympus，型号：SZ-ST）
　　2.清洁工作台（LabTech，型号：LCB-1201V）
　　3.解剖工具
　　a.止血钳（KASCO，目录号：S8-099）
　　b.微型解剖钳（KASCO，目录号：50-2000-1）
　　c.微型剪刀（Medro Instruments，目录号为02-027-10）
　　d.电子钳（KASCO，目录号11-412-11）
　　4.离心机（LaboGene，目录号：1248R）
　　5.血细胞计数板（Marienfeld superior，目录号：HSU-0650030）
　　6.CO2细胞培养箱（PHCbi，目录号：MCO-18AC-PK）
　　7.37°C水浴（DAIHAN Scientific，目录号：DH.WHB0016）
　　8.磁性细胞分选仪（Magnetic cell separator）（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102） 三、实验软件ImageJ（美国国立卫生研究院，https://imagej.net） Prism 7 (GraphPad, https://graphpad.com） Biorender (Biorender, https://biorender.com） 四、操作步骤
　　神经上皮细胞-小胶质细胞始祖细胞混合培养物形成融合状态，有助于改善小胶质细胞的存活率，提高小胶质细胞产量。组织解剖和细胞培养的步骤如下：
　　注：此步骤应在清洁的工作台进行。
　　步骤一：小鼠小胶质细胞的分离和培养
　　1.用5mL多聚赖氨酸PDL包被T-25培养瓶，于加湿培养箱（5% CO2，37°C）静置2小时。培养瓶使用前，需要用5mL蒸馏水清洗瓶底3次并干燥后备用。
　　2.准备实验所需的器械和试剂。用70%酒精喷洒解剖器械和工作空间。在37°C水浴中温育细胞培养液。
　　3.从饲养笼中取出怀孕第13天的小鼠，腿部肌肉注射（i.m.）0.03 mL戊巴比妥（生理盐水溶解，100 mg/kg）进行麻醉。
　　4.用微型剪剪开小鼠腹壁，显微解剖镊抬起子宫角，用剪刀切取子宫并置于预冷（4°C）的HBSS溶液中。
　　5.室温（20-25°C）下，用微型剪在含有20 mL HBSS溶液的100 mm培养皿中切除子宫肌肉组织，然后，同时用两个电子钳夹住子宫组织，将其拉开并取出小鼠胚胎，接着，剪切胚胎之间的区域并分离单个胚胎。
　　6.取新的100 mm培养皿，并添加20 mL常温HBSS溶液。
　　7.将取出的小鼠胚胎（6-10个）转移到上述准备好的培养皿中（图2） 。
　　8.一只手用钳子拿起一个胚胎，另一只手切取眼睛以上的头部皮肤（图3，视频1） 。
　　9.将剪切下的组织转移到EP管。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，用微型剪将组织剪碎。用1 mL移液器温柔反复吹打，然后置于37°C细胞培养箱中3min进行消化。
　　10.将消化好的细胞悬液转移到15mL离心管，加入10mL常温DPBS缓冲液，室温下以300 g离心5min。
　　11.吸掉上清并用5mL温热的培养基重悬细胞沉淀。
　　12.使用细胞密度计数板计算细胞密度。
　　13.将细胞悬液以200000细胞/cm2的密度种植到底部包被好的T-25培养瓶，加入细胞培养基至最终体积为7mL。将培养瓶放入37°C，5%CO2的细胞培养箱。
　　14.次日更换新鲜培养基，之后每2-3天更换1次以清除细胞碎片。
　　15.细胞种植14-21天后，检查培养瓶中的细胞密度（图4） 。当密度达到90%时，将细胞分至两个培养瓶。
　　注：如果混合细胞增多达到融合状态，但小胶质细胞不是即刻需要，则可以储存细胞。细胞可以储存在含有20%FBS, 10%DMSO的DMEM冻存液中，长期储存于液氮（约-196°C）。解冻混合细胞时，需在37°C水浴中溶解冻存管3min，并用培养液稀释。
　　步骤二：从NEL培养物中纯化小鼠小胶质细胞
　　1.为了收集小胶质细胞，在步骤一15培养的细胞加入1 mL 0.25%胰蛋白酶孵育3min。
　　2.轻轻拍打T-25培养瓶，收集培养基中的悬浮细胞到15mL离心管中。
　　3.加入10mL DPBS，以300×g离心5min，完全吸除上清。
　　4.每107个总细胞加入90 μL预冷的PB缓冲液，上下轻柔晃动以重悬细胞。
　　5.加入10 μL小胶质细胞 CD11b磁珠（MicroBeads）。
　　6.充分混合并在4°C避光孵育15min。
　　7.每107个细胞加入1mL预冷的PB缓冲液清洗细胞，300×g下离心5min。完全吸除上清液。
　　8.用1500μL PB缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为107个细胞。
　　9.将分选柱置于合适的磁性细胞分选仪（MACS）的磁场中，并用500μL PB缓冲液清晰分选柱。
　　10.将上述准备好的细胞悬液缓慢加到分选柱中，并收集未标记细胞的细胞液，将收集到的细胞液重新加入分选柱再次分选，并再次收集未标记细胞的细胞液的，重复3次，每次在分选柱排空后再进行下一次操作（MS分选柱：500 μL × 3）
　　11.用移液管将1mL PB缓冲液加到分选柱，立即将柱塞牢固地推入柱中，冲洗磁性标记的细胞，即获得小胶质细胞（图5） 。
　　注：为提高小胶质细胞的纯度，建议将获得的细胞通过第二次MS分选柱以进一步富集阳性细胞。使用新的分选柱重复步骤二9-11所述磁性分离步骤。 五、代表性流程图和结果图
　　图2.  解剖小鼠胚胎以获取神经上皮层（NEL）培养物。 首先，通过剪切连接胚胎的子宫组织来分离单个小鼠胚胎。其次，将单个胚胎转移到一个新的含有预冷HBBS的培养皿中，每6-10个胚胎使用一盘新鲜HBBS。最后，使用显微解剖钳解剖胚胎头部皮肤。
　　图3.  解剖小鼠胚胎用于NEL培养 。在显微镜下使用显微外科器械解剖小鼠胚胎的NEL
　　图4.  从NEL培养中获得可扩增的小胶质细胞。 箭头指向NEL支撑的小胶质始祖细胞。比例尺=100μm
　　图5.  从培养了21天的NEL中分离并纯化到的小胶质细胞。 用小胶质细胞标记物IBA-1、CX3CR1和TMEM119对细胞进行免疫荧光染色。明视野显微镜图像显示了细胞形态。比例尺=100μm   六、配方
　　1. 细胞培养液 （500 mL）
　　试剂
　　终浓度
　　体积
　　DMEM
　　n/a
　　450 mL
　　FBS
　　10%
　　50 mL
　　Pen/Strep
　　1%
　　5 mL
　　GlutaMAX
　　0.5x
　　500 μL
　　Total
　　n/a
　　505.5 mL
　　2. 70%乙醇
　　试剂
　　终浓度
　　体积
　　Ethanol (absolute)
　　70%
　　70 mL
　　H2O
　　n/a
　　30 mL
　　Total
　　n/a
　　100 mL
　　3. 戊巴比妥溶液（2 mL）
　　试剂
　　终浓度
　　体积
　　100mg pentobarbital
　　3mg
　　2 mL
　　Saline
　　n/a
　　8 mL
　　Total
　　n/a
　　10 mL
　　4. 0.25%胰蛋白酶
　　试剂
　　终浓度
　　体积
　　2.5% Trypsin
　　0.25%
　　1 mL
　　DPBS
　　n/a
　　9 mL
　　Total
　　n/a
　　10 mL
　　5. PB缓冲液
　　试剂
　　终浓度
　　体积
　　BSA
　　0.5%
　　0.25g
　　DPBS
　　n/a
　　50mL
　　Total
　　n/a
　　50 mL 七、参考文献
　　Bio-Protocol  原文信息： M. J. and Kwon, M. S. (2022). A Step-by-step Protocol for Obtaining Mature Microglia from Mice.  Bio-protocol  12(15): e4481. DOI: 10.21769/BioProtoc.4481.
　　参考文献： You, M. J., Rim, C., Kang, Y. J. and Kwon, M. S. (2021). A new method for obtaining bankable and expandable adult-like microglia in mice.  J Neuroinflammation  18(1): 294.  Bio-protocol 简介
　　Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。  Bio-protocol  期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，  Bio-protocol  已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同   Science  、  eLife  等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年  Bio-protocol  期刊已被PubMed Central，ESCI收录。