GenomeBiology基于ITER平台的小麦和玉米Cas12a碱基编辑系统的优化

　　碱基编辑器(BE)是非常有用的生物技术工具，可以在特定的DNA位点上产生精确的核苷酸替换。目前主要有两种类型：胞嘧啶(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。ABE来源于一种进化的大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶TadA，该酶催化腺嘌呤转化为肌苷，肌苷被修复为鸟嘌呤，导致A-G转变。ABE与CBEs不同，修复更精确，观察到的Indel更少。目前，很少有报道将Cas12a用于碱基编辑，因此构建高效的Cas12a-BE以增加植物的靶向范围 (5＂-TTTV-3＂ PAM)是非常必要的。
　　近日，比利时根特大学Christophe Gaillochet团队在国际知名期刊Genome Biology上在线发表题为＂Systematic optimization of Cas12a base editors in wheat and maize using the ITER platform＂的论文，目前该团队开发了基于96孔阵列原生质体转染和高含量成像的ITER平台（编辑载体的迭代测试）。实验结果表明，ITER是一个灵敏、多功能和高通量的平台。随后，该团队使用ITER创建优化了一个高效的Cas12a-ABE。结果表明ITER可以有助于在植物物种中创建和优化基因组编辑载体。
　　ITER是一个将阵列原生质体转染与高含量成像相结合，以有效地测试和优化各种各样的基因组编辑工具平台（图1)。实验结果表明，ITER可以有效地检测多重C-to-T或A-to-G碱基编辑，是检测小麦和玉米原生质体碱基编辑的有效平台。
　　图1 ITER的创建与验证
　　随后该团队利用ITER在小麦上开发和优化了 Cas12a-ABE。实验结果表明碱基编辑效率明显提高，且玉米原生质体中Cas12a-ABE活性逐步增加，这表明ITER对载体的优化可以扩展到其他植物物种。并确定了导致小麦和玉米ABE、CBE和核酸酶活性提高的关键原因。
　　图2 Cas12a-ABE的逐步优化
　　该团队建立的ITER可以使用全自动成像和分析管道来测试和量化基因编辑结果。一个迭代循环可以在大约三周内进行，其中第一周创建新的克隆，第二周组装和验证载体面板，第三周进行质粒放大、转染和分析。ITER对转染效率进行自动归一化处理，即使样品之间的转染效率方差很大，也能有效地处理多次重复，从而有效的检测低效信号。
　　图2 Cas12a-ABE在小麦和玉米内源靶标的活性验证
　　原文链接：
　　https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-022-02836-2#Sec2
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