文献解读用于活细胞纳米观察的无笼基团光激活荧光团通用策略

　　文献解读
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　　研究介绍
　　荧光团在非荧光状态和荧光状态之间的受控切换在每种超分辨率荧光显微镜技术中都起着关键作用，而探索全新的切换机制对于已有的和新兴的超分辨率方法性能提升仍至关重要。在该研究中，作者提出了一种将3,6-二氨基氧杂蒽酮转化为无笼基团的光活化荧光团的通用方法。可光活化的呫吨酮 (PaX) 在用光照射后能高效、清洁地转化为高荧光、光和化学稳定的吡咯啉染料。同时，该策略也能扩展到碳和硅桥联的蒽酮类似物，产生一系列足以覆盖大部分可见光谱的可光活化标签。研究结果证明了PaX染料在常规显微镜的固定细胞及活细胞标记中具有多功能性和实用性，以及在STED、PALM和MINFLUX的坐标随机和确定性纳米观察中的多功能性和实用性。
　　荧光纳米显微镜以个位数纳米分辨率实现了对具有分子特异性的生物样品内部结构和动力学的微创观察，大大提升了我们观察（活）细胞的能力。而这些技术的核心在于化学特异性荧光标记和荧光团的开-关状态之间的内在控制。由于开关转换不可逆的光活化染料或笼状染料在使用时无需特定的成像缓冲液和高强度紫外线，因此，它们在单分子定位显微技术中被广泛使用。如今光活化染料已被用于减少DNA涂料中的荧光背景，并用于提高可通过通道叠加在受激发射损耗 (STED) 显微镜中同时成像的细胞结构数量。其中，罗丹明染料因其光学和化学稳定性，细胞膜渗透性和亮度的显著可调性，已成为荧光显微镜和纳米显微镜中使用得最多的荧光团之一，特别是硅罗丹明染料，因其出色的红移发射、稳定持久的荧光信号、良好的活细胞相容性和亮度而受到青睐。
　　在这之前，已报道的罗丹明的笼化策略一般都是依赖于以非荧光形式＂锁定＂染料，即通过在氮原子上安装耐光保护基团(如硝基藜芦基氧羰基或亚硝基)，或者通过内酯环合成转化为相应的环α-重氮酮。然而，这两种策略都存在一定的局限性，前者会降低染料的水溶性，并在光活化时产生潜在的毒副产物，而后者则会形成不同的非荧光副产物，导致主产物丰度降低。因此，在荧光显微术和纳米技术中，如果要求光活化能够以快速的、完全的并且没有副产物的方式进行，那么无笼基的、紧凑型光活化的以及生物相容的荧光团是非常必要的。
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　　研究结果和讨论
　　1、光活化标签的合成设计和机理
　　在这里，作者对反应机理做出了猜想和验证（图1b），PaX在受到405nm波长的光照后，由基态跃迁至激发态，与尚在基态的助剂上的孤对电子作用，使电子从助剂转移到PaX上，之后通过烯烃上的电子转移形成新的六元环，经过环内电子转移后，最后经质子化形成封闭式PaX-CF。
　　图1、PaX染料的设计、合成和表征
　　a、作者采用了一种依赖于荧光团的光诱导组装 (＂锁定＂)方法，在传统方法中，用于纳米镜的光活化染料一般依赖于笼状基团的释放 (＂解锁＂)。
　　b、具有1-烯基自由基阱及其9-烷氧基吡啶光产物 (闭合形式，CF) 的PaX的一般结构，以及所提出的光激活机理。
　　c、制备PaX的合成路线。
　　d、在磷酸盐缓冲液（100 mM，pH 7；λact = 405 nm）中化合物1 (1.66 µg ml-1) 随时间变化的吸收光谱和荧光光谱。
　　e、在与d中相同的条件下，比较硅桥PaX 1–6的光活化动力学。
　　f、在与d相同的条件下，比较PaX染料9-12的光活化动力学。
　　g、比较化合物11 (3.8 µM) 在不同pH值 (λact = 405 nm) 的磷酸盐缓冲液 (100 mM) 中的比较光活化动力学。
　　h、在磷酸盐缓冲液（λexc = 530 nm）中测量具有相似光谱特性的 11-CF 和已建立的商业荧光团的抗光疲劳性。
　　为了研究自由基受体取代的影响，作者合成了一系列可光活化的Si-xanthones (1-7; 图1c)。目标产物是通过铱催化，螯合辅助，邻位选择的二芳基酮C-H硼化反应(A)制备的。在KF作用下，经CuBr2-吡啶体系将生成的硼酸酯(B)转化为相应的芳基溴(C)，最后在标准 Suzuki-Miyaura 交叉偶联反应条件下进行一系列烯烃取代。
　　2、用于纳米镜的无笼状基团的光活化标签
　　图2、用于光学纳米镜的光激活标签
　　a、用于生物偶联 (13, 14) 和肌动蛋白标记 (15) 的PaX560衍生物的结构。
　　b、COS-7细胞中微管的STED（左）和PALM（右）图像，用带有13的二抗间接免疫荧光标记。
　　c、固定的初级海马神经元培养物轴突中周期性膜细胞骨架的肌动蛋白结构，用15标记并置于Mowiol中。
　　d、通过间接免疫荧光标记的COS-7细胞中NPC的PALM图像，用抗NUP98一抗和用 14标记的二级纳米抗体。
　　e、表达NUP107-mEGFP的HeLa-Kyoto细胞中NPC的PALM图像，用与14偶联的抗GFP 纳米抗体标记。
　　比例尺：2 μm（b-e，主图像），500 nm（d，e插图），50 nm（d，底部），100 nm（e，底部）。
　　3、用于活细胞成像的靶向标签
　　图3、在活细胞中使用可光激活PaX标签进行成像
　　a、用于活细胞成像的PaX560衍生物 (19-22) 的结构。
　　b、COS-7 细胞与19 (200 nM) 和 MitoTracker Deep Red (50 nM，上层) 或 20 (20 nM) 和 SiR-溶酶体 (200 nM，下层)共孵育的共聚焦图像和相应的Pearson相关分析）。使用355 nm激光实现向19-CF和20-CF的转换。
　　c、U2OS细胞中波形蛋白丝在激活前（上层）和双光子激活（2PA）（下层，箭头所示）标记为21（200 nM）的共聚焦图像。
　　d、单光子（355 nm，100% 时为0.3 µW）或双光子激活激光器（810 nm，10%时为109 mW）的激活率与激光功率的关系图。
　　e、同一样品在405 nm激光激活后的共焦（顶层）和 STED（底层）图像。
　　比例尺：5 µm (b,c)和1µm (e)。
　　4、通过选择性光激活多路复用 PaX 标签
　　考虑到PaX染料的光活化速率的差异，作者推测两个互补的标签可用于多路复用，依次应用较低和较高剂量的激活光，首先转换一个荧光团（例如PaX560），同时保留较难激活的荧光团（例如PaX480 )，直到施加较高的光剂量。首先作者通过共焦成像测试了这一点，然后通过双色单检测器 PALM成像在固定的细胞中测试，用细胞器（Pax560–Mito 19或Pax560–Lyso 20）和Halotag特异性（Pax480–Halo，23）标记，通过共聚焦成像进一步证明了活细胞中的顺序激活。
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　　研究结论
　　作者引进了一种无笼组、明亮和活细胞兼容的光活化染料的通用设计策略，适用于广泛的光学显微镜和纳米技术，包括PALM、STED和MINFLUX。这些PaX染料的独特结构特征将光响应性3,6-二氨基呫吨酮核心与分子内烯烃自由基阱功能化，从而提供高度紧凑且本身不带电、完整的细胞膜可渗透标记。在单光子或双光子活化下，这些化合物迅速形成高度光稳定的荧光吡咯啉染料。通过改变PaX染料的取代基，可以改变光活化动力学以及光谱特性，从而实现多路复用伪彩色和传统的多色成像。
　　在固定和活细胞超分辨率荧光显微镜实验中，PaX染料的实用性和多功能性经过各种目标特异性探针和标记策略得到了证明。这种方法将会进一步刺激用于生物成像和材料科学的光活化探针和传感器的发展。
　　（更多研究解读将于后续分享）
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　　超高分辨率显微成像系统
　　iSTORM
　　宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM，采用了源自诺贝尔化学奖原理的 STORM 超高分辨率显微成像技术, 实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在 20 nm的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及超分子结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实，从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
　　图4、力显智能自主研发的超高分辨率显微成像系统iSTORM。
　　超高分辨率显微成像系统 iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同时成像、3D同步拍摄、实时重构、2小时新手掌握等特点，已实现活细胞单分子定位与计数，并提供荧光染料选择、样本制备、成像服务与实验方案整体解决方案，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。
　　参考文献：
　　Lincoln, R., Bossi, M.L., Remmel, M. et al. A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy. Nat. Chem. (2022).
　　延伸  ·  阅读
　　□  【前沿进展】诺贝尔奖STORM技术在脑膜炎球菌研究中的应用
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