一种从生物流体中分离细胞外DNA的实验方法

　　该篇实验方法已经在  Shock  文章＂Early Dynamics of Plasma Dna in a Mouse Model of Sepsis＂中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在 Bio-protocol 期刊，欢迎大家进入Bio-protocol 期刊直接与作者交流。
　　简 介
　　在这篇Bio-protocol文章中，来自斯洛伐克夸美纽斯大学和英国爱丁堡大学的研究人员为我们描述了一种生物流体中细胞外DNA的分离和定量的方法。
　　亮 点
　　1.该方法详细阐述了从生物流体中分离和定量细胞外DNA的操作过程，有利于提高实验的可重复性。
　　2.该方法为细胞外DNA分离的体液处理提供了标准化的方案，对研究细胞外DNA作为生物标志物以及作为与损伤相关的分子模式具有重要价值。
　　背景介绍
　　细胞外DNA通常被称为无细胞DNA，是指在细胞外（尤其是在诊断性生物体液中）发现的所有DNA。细胞外DNA可以在细胞凋亡或坏死期间从死亡细胞中释放出来，而健康人的细胞外DNA大部分来源于血液成分。血浆DNA由Mandel和Metais（1948）首先发现，之后，对所谓的液体活检作为一种基于DNA的非侵入性筛查和诊断生物标记物的研究激发了研究人员对细胞外DNA研究的兴趣。此外，细胞外DNA也参与了炎症疾病的病理生理，如脓毒症、急性肾损伤和急性肝功能衰竭等。
　　因此，细胞外DNA的定量评估对于广泛的研究课题至关重要。然而，当涉及到细胞外DNA测量时存在许多限制。在动物实验中，可用的血液、尿液或唾液量极大地限制了后续的分析。由于在用于样本收集、处理、分离和量化等研究方面的程序有所不同，这使得血浆、尿液或唾液中细胞外DNA浓度无法使用标准正常范围。通常，抑制脱氧核糖核酸酶活性的含有EDTA的管子主要用于从血浆中分离细胞外DNA。对尿液或唾液的取样并没有标准化，常常通过冷冻保存样品。然而，冻融会导致细胞外DNA非必要的降解。作者未发表的观察表明，从新鲜和冷冻的血浆中分离DNA会导致细胞外DNA的大小完全不同。通常，在DNA分离之前，会进行两次连续离心以从体液中去除细胞和较小的细胞碎片。然而，并不是所有的研究都遵循这一程序，因此无法比较使用不同分离和量化方法的研究结果。由于细胞外DNA浓度的测量具有很高的技术可变性，使用一式两份或一式三份可帮助实现可重现的结果。因此，用于细胞外DNA分离的体液处理方案的标准化将对研究细胞外DNA作为生物标志物以及作为与损伤相关的分子模式具有重要价值。
　　在这篇protocol中，作者描述了一种生物流体中细胞外DNA的分离和定量的方法，该方法可适用于从血液、尿液、唾液或其他体液中分离和定量细胞外DNA，提供了一种标准化方案。
　　步骤节选
　　step A. Sample processing
　　step B. Isolation of extracellular DNA
　　step C. Quantification of total extracellular DNA using single tubes
　　step D. Quantification of total extracellular DNA using a plate reader
　　step E. Quantification of nuclear and mitochondrial extracellular DNA using real-time PCR
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　　原文链接：  https://s.bio-protocol.org?s=866b025eaffb08a3
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　　Bio-protocol 简介
　　Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。  Bio-protocol  期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，  Bio-protocol  已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同  Science  、  eLife  等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年  Bio-protocol  期刊已被PubMed Central，ESCI收录。