抗体药物早期研发成功的关键CHO稳定细胞株构建

　　生物药开发是一个非常复杂的过程，而构建适用于工业生产的高表达的细胞株是第一步也是最关键的步骤之一。CHO细胞的GS筛选系统是工业上用得最广泛的筛选系统。CHO细胞GS筛选系统主要有以下优点：
　　① CHO细胞遗传背景清楚，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
　　② GS筛选系统产量高，周期快，工业认证度高。
　　普健生物拥有丰富的重组表达抗体生产经验及稳转细胞株构建经验，在这里给大家分享一种高效的抗体药开发CHO细胞株构建策略。
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　　GS筛选系统原理
　　哺乳细胞的生长离不开谷氨酰胺，谷氨酰胺合成酶是一种能将谷氨酸和氨合成为谷氨酰胺的酶。这种酶促反应是动物细胞获得谷氨酰胺的途径。
　　CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低，无法表达足够的谷氨酰胺维持细胞快速生长，必须在培养基中添加外源的谷氨酰胺。GS抑制剂，L-氨基亚砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine，MSX），可用于抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体，转染宿主CHO细胞，通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增，只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有L-glutamine的培养基中生长，从而筛选获得重组表达细胞株。
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　　筛选策略
　　2.1 宿主细胞选择
　　工业上主要使用两大类CHO 细胞：① GS野生型，含弱的GS活性（GS WT）：CHO-K1（ATCC CCL-61，ECACC 85051005），CHOK1SV（lonza)；② GS缺陷型，敲除GS活性（GS KO）：CHOK1SV-KO（Lonza),CHOZN（Merk）,HD-BIOP3(Horizon)。
　　使用这些商业化的细胞株，需要支付高额的专利费用。普健生物凭借近十年的抗体药物研发项目经验，自主开发了CHO-GS KO细胞系及GS载体系统，经过大量的重组表达项目验证，产量高达3g/L以上，稳定性好。
　　2.2 细胞株筛选方案
　　① 重组载体构建。选择适合的信号肽，对抗体重轻链基因进行密码子优化。将目的基因构建到普健专有的GS载体上。
　　② 转染及Minipools筛选。使用普健生物专利的CHO细胞转染方法进行转染。转染48h后，加压筛选Minipools。利用Elisa 或Octet进行初筛，选取最优的30个minipools，逐级扩大培养至TPP摇管中，利用简单的流加表达工艺筛选出3株最优的minipools。
　　③ 细胞株单克隆化。采用特定的有限稀释方法铺板，Imager跟踪成像。利用Elisa或Octet进行初筛，选取最优的30个monoclones，逐级扩大培养至TPP摇管中，利用简单的流加表达工艺筛选出10株最优的monoclones。将10株最优的monoclones传至摇瓶中，利用特定的摇瓶工艺对10株monoclones 进行细胞生长特性，代谢特性，产量，抗体糖基化修饰，抗体聚体等质量分析，综合筛选出最优的3株生产用细胞株。
　　④ 个性化产量优化和糖型调节。普健生物有多种基础培养基，补料培养基及流加表达培养方案。可以根据不同的细胞株生长特性， 筛选出最优的流加表达工艺。同时，也可以用特定的调糖培养基调节不同的糖型的比例。
　　⑤ 完善的抗体质量评估系统。主要包括抗体效价，活性分析；抗体聚体分析；抗体糖基化分析；抗体效能分析等。
　　⑥ 生产细胞株稳定性分析。包括基因型稳定性分析及30个代次的传代稳定性分析。
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　　案例展示
　　图1 单克隆产量分析
　　图2 流加表达测试产量优化
　　图3 抗体聚体分析（SEC-HPLC）
　　图4 抗体亲和力分析（Biocore）
　　图5 细胞株稳定性分析图
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　　普健生物稳定细胞株构建服务
　　普健生物拥有高效的CHO稳定细胞株构建体系，从上游的杂交瘤抗体测序，到序列优化，人源化，再到细胞株构建，个性化细胞株优化及质控检测，整个技术体系成熟，仪器配备齐全，能够快速助力抗体药的临床前研究。 普健生物凭借近十年的抗体药物研发项目经验，自主开发了CHO-GS KO细胞系及GS载体系统，抗体表达产量>3g/L以上。自主研发了CHO细胞专利转染技术，及提高抗体产量的稳定细胞株筛选技术。拥有完善的抗体质量分析平台，可以提供Elisa、FACS、还原/非还原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。广大科研工作者如果有需要可以点击相关网页咨询。
　　服务流程
　　服务优势
　　高质  ：外源基因严格鉴定，细胞来源清晰，无污染。
　　高产  ：重组蛋白/抗体表达量可快速优化至2g/L以上稳定表达。
　　稳定  ：独有的GS稳转系列载体配合MSX药物筛选，实现稳定传代15-30代以上。
　　快速  ：筛选高产细胞株，周期短至3个月。
　　灵活定制  ：可针对重组蛋白/抗体全长或片段进行个性化表达。
　　经验丰富  ：专业的技术团队，已成功为国内外多家医药公司和研究单位构建交付稳定细胞株。
　　多筛选系统  ：G418/潮霉素/嘌呤霉素筛选系统，GS/DHFR 筛选系统等。