天然产物的合成生物学研究

　　作者   叶少杰 秦嘉豪 路斯博 魏岱旭
　　天然产物有很好的生物学活性且应用广泛，但传统的生物提取和化学合成获得天然产物存在操作复杂、成本高、效率低等不足。合成生物学可利用微生物这一＂合成工厂＂，构建并生产出结构多样的天然产物，具有高效、经济、环境友好等优点。
　　合成生物学是21世纪诞生的一门交叉学科，它结合了传统的生物工程和系统生物学概念，旨在建立人为设计的生物系统，即将基因连接成网络，利用宿主细胞（底盘细胞）完成设想的相关任务，具体过程一般包括底盘细胞的构建、合成元件的挖掘与采用、合成途径的设计以及细胞合成工厂的创建。由于微生物具有代谢速率高、培养条件易控制、可通过生化反应器放大其规模等诸多优点，所以目前普遍将微生物作为底盘细胞。
　　利用合成生物学技术生产目的产物具有高效、经济、环境友好等一系列优点，因此，运用该手段针对各种化学品、新型非天然药物、天然产物等的研发与应用正在如火如荼地展开。有研究团队利用转录组和代谢组的关联分析，确定并全面解析了黄芩素的整个生物合成途径，再用生物合成技术生产产品 [1]；有研究人员以嗜盐单胞菌为研究对象，实现了聚羟基脂肪酸等高分子材料、化学品和燃料的生物制造，其可应用于医疗、环境等领域 [2-5]；另有研究团队长期以深海、极地等极端环境的微生物和动植物共生生物为研究对象，克隆并鉴定了多种抗生素的基因簇，开展关于非天然抗生素药物的合成生物学研究，获得了大量新型的抗生素衍生物，推动了我国微生物药物生物合成领域的发展 [6]；还有实验室利用逻辑门的概念（指具有与计算机所用电路逻辑门类似信息处理能力的基因线路组件），成功设计并构建了基因线路，实现了对于膀胱癌细胞的识别和治疗 [7]。合成生物学的不断发展和完善为能源、材料、医疗、食品、日化等行业提供了更多的产品支撑。
　　结构多样的天然产物
　　天然产物具有很好的生物学活性，广泛应用于医药、食品、香料、化妆品等方面。然而，从植物或动物本身提取天然产物的步骤十分烦琐，且收益低，同时由于其结构复杂，利用化学合成天然产物也会带来很大的困难，因此生物合成法就成为一个值得考虑的新方法。
　　萜类化合物
　　萜类化合物是自然界广泛存在的一大类异戊二烯衍生物，主要从植物、微生物及海洋生物中分离得到。萜类通式是 (C5H8)n（n是异戊二烯的单元数）。其目前已鉴定得到的种类有55000多个，占所有天然化合物的60% [8]。
　　萜类不但具有广泛的抗癌功效 [9]，还有消炎、降糖等药理作用。三萜皂苷类能够消炎、抗过敏、抗病毒、降血糖、治疗白血病，以及防治心脑血管等疾病 [10]。此外，很多植物源萜类化合物是芳香性挥发性物质，被广泛应用于香料、香水、调味剂及化妆品等行业 [11]。萜类结构的多样性还使其成为汽油、柴油等燃料的高级替代物。例如单萜蒎烯、柠檬烯、半萜异戊烯醇、异戊醇等均是公认的燃料及燃料的前体物。
　　萜类在植物中的含量通常很低，且植物提取法还存在野生资源稀缺、分离效果不佳、产量极低的问题。化学合成法虽解决了植物提取法中的诸多问题，但仍存在原料昂贵、工艺流程复杂、立体选择性低、污染大、总收率偏低等问题。而生物合成法则不受原料的限制，具有生产过程绿色清洁、产物单一、产率提升空间大等优势。生物合成法有两种，一种是通过代谢工程手段直接在植物中促进萜类化合物的合成，然而由于植物生长缓慢且体内代谢过程错综复杂，所以这种萜类合成方法面临着目标产物产量有限、后期分离困难、生产周期长等问题；另一种是通过合成生物学的方法在微生物等底盘细胞中合成目标产物。目前，对于萜类合成生物学的设计策略一般可以分为两部分：一是底盘细胞的选择及改造；二是萜类合成途径的挖掘。
　　底盘细胞的选择及改造是实现合成生物学方法用以生产萜类化合物的基础。选取不同的底盘细胞对于萜类的生物合成有关键性的影响，例如大肠杆菌主要用于酮、醇、酸等化学品而非萜类的生物合成。另外，由于细菌缺少翻译后修饰而难以表达细胞色素，且很多萜类化合物具有抗细菌活性，因此多采用酿酒酵母等真核生物进行萜类的生物合成。利用酵母细胞的好处是酵母能够直接合成较多的二甲基丙烯基二磷酸和异戊烯焦磷酸，从而为萜类合成提供大量的前体物。其优势有三点：一是选用酵母作为底盘细胞可以通过酵母基因组的必需基因分析，保留最小基因组，从而在萜类的生物合成过程中减少其内源消耗；二是所有基因工程操作都可以通过染色体融合完成，这样可以保证酵母工程菌株的遗传稳定性；三是可以通过对酵母细胞进行耐高温、耐酸、耐盐等抗逆改造。
　　萜类合成途径的挖掘是从自然中寻找合适的萜类化合物生成与表达的相关基因，并将其加入人工设计的基因表达系统内，从而直接或间接实现对萜类物质的生物生产流程的优化或创造。无论何种产物，其相关合成途径的挖掘是合成生物学快速发展的保障。随着全基因组测序、第二代 DNA 测序技术以及宏基因组学技术的发展，越来越多的天然产物代谢途径被挖掘出来，并且植物萜类化合物的合成往往伴随着基因表达簇结构的发现。随着对异源基因的密码子优化、启动子终止子的选取和搭配组合优化、合成途径的标准化组装、发酵条件摸索及发酵工艺优化等方面的深入研究，萜类合成关键酶的异源高效表达以及萜类的合成能力已经得到了很大的提高。
　　当前通过对萜类的生物合成途径的鉴定研究，设计开发出越来越多的组合调控萜类合成途径的功能模块，并在底盘细胞中创建合成工厂，已可实现萜类的体外合成。因此，合成生物学的发展为实现微生物发酵生产萜类提供了有力的支撑。
　　生物碱
　　生物碱是一类含负电荷氮离子的、具有环状或非环状结构的次生代谢产物，广泛存在于诸多生物分泌物中。植物界中的罂粟科、豆科、兰科以及麻黄科等普遍会分泌生物碱；动物界中有蟾蜍分泌的蟾蜍碱、麝香中的麝香吡啶、加拿大海狸香腺中的海狸碱等。生物碱普遍具有抗菌、抗癌、镇痛等作用，也是当今抗肿瘤、心血管疾病相关药物研发生产的重要资源。然而，由于植物生长缓慢且体内生物碱含量较低，无法满足市场需求。因此用合成生物学的方法实现生物碱的规模化生产是很好的方法。
　　青蒿素是我国发现的第一个被国际公认的抗疟首选天然药物，其结构为含过氧桥基团结构的倍半萜内酯类化合物。众多科研人员通过接力式的研究，先后实现了将青蒿中的紫穗槐-4,11-二烯合酶在酵母中过表达（实现了青蒿素合成前体紫穗槐-4,11-二烯的合成）、启动子和代谢流优化、整合细胞色素酶、脱氢酶，再通过添加过程代谢物等手段，目前已使得酵母中青蒿酸的含量达到 25 克/升，初步达到工业化生产水平。可以说，青蒿素是目前利用合成生物学技术实现产业化最为成功的典范之一。然而，实现低成本工业化生产青蒿素等众多生物碱的探索道路仍然任重道远。
　　目前，利用合成生物学手段实现实际社会生产中的天然产物合成仍然存在着诸多挑战。例如原核表达系统、细胞内无高级细胞器、缺乏转录后修饰，而酵母作为真核表达系统必须人为地将内含子从蛋白质编码序列中删除。越来越多的生物技术，如构建基因库、蛋白质工程、高通量筛选以及 CRISPR/Cas9 基因编辑技术等的发明与应用可解决上述难题。这些不断完善的新生物合成工具正随着具有重要药用价值的生物次生代谢物的生产成本与资源协调等相关问题的解决，逐步创造着更加可观的未来。
　　参与生物合成的工具酶
　　天然产物的生物合成过程离不开一个关键物质——酶。对于我们人类自身来说，情绪波动、思维跳动、身体运动都离不开各种酶类。酶在各种生物体内含量虽微小但却起着举足轻重的作用。天然产物的合成更离不开它们。参与天然产物生物合成的这些酶类被称为工具酶。顾名思义，就是合成天然产物的＂工具＂。主要包含途径酶和后修饰酶 [12]。
　　途径酶
　　途径酶，即合成天然产物相关生化反应途径过程中的酶类，是由底物生成某种产物的先决条件。
　　氧化还原酶（催化氧化还原反应的一类酶）就是一大类关键的途径酶，其在生物体的氧化产能、解毒以及某些生理物质形成等过程中起重要的作用，属于第一大类酶，在生物界中存在且数量庞大。而在催化作用中，一般都需要辅酶或辅基参加，其通常可分为4个亚类：①脱氢酶，催化从底物上脱氢反应的酶；②氧化酶，催化底物脱氢，并把氢交给氧气生成过氧化氢或水的酶；③过氧化物酶，催化以过氧化氢或其他过氧化物为氧化剂反应的酶；④氧合酶，催化氧原子直接参与有机分子反应的酶。
　　目前，天然产物的生物合成中主要的困难是氧化还原酶结构复杂，具有辅酶和底物等多个结合位点，且往往由多个亚基组成，因此在反应过程中容易失活。而提高氧化还原酶的稳定性主要有酶分子结构改造和固定化两种途径 [13]。氧化还原酶的固定化需要在材料选取和固定化方法选择方面，例如酶固定化载体的化学组成、界面性质以及微观结构等对酶的稳定性、电子传递、底物和产物扩散过程的影响等多做考虑。目前广泛使用的载体材料分为高分子材料、碳材料、聚合物—无机复合材料、金属—有机框架材料等。这些材料具有稳定性好、机械强度高、化学惰性、孔隙率高、比表面积大等优势，并可通过表面可控修饰获得生物相容性好的固定化载体。
　　另外一大类途径酶即限速酶。在天然产物的生物合成中，要想控制产率和产速，应从反应途径入手。而调节反应途径中对酶的调控在很大程度上是对限速酶的调控。如果把人体内的生化反应过程想象成道路上行驶的汽车，那么限速酶就如同限速摄像头，超速行驶的车辆遇到摄像头便会放缓速度，通过这样的方式达到提高安全系数的目的。人体的基础代谢，如糖酵解、糖异生、三羧酸循环中都有限速步骤，限速酶能够影响反应的速度及进行与否。
　　后修饰酶
　　后修饰酶可以对天然产物进行结构修饰，丰富天然产物的结构多样性，改善天然产物的性质，增加筛选获得活性天然产物的概率。简单来说，后修饰酶就是对途径酶催化后的产物进一步优化，使其具有更强的效能。后修饰酶包括甲基转移酶、酰基转移酶、脂肪酶、氧化酶、糖基转移酶和糖苷水解酶等。目前非常热门的表观遗传学领域研究的就是环境因素导致生物的基因表达不同的问题。基因表达的不同与基因修饰密不可分，当然也就与后修饰酶密不可分了。如果我们把途径酶比作一个熟练的工匠，那么后修饰酶就是精巧的刻刀，两种酶之间只有熟练地配合，才能实现天然产物的生物合成。
　　天然产物的生物合成流程
　　合成生物学技术的新发展
　　构建大肠杆菌工程菌
　　研究者通常可参考生物合成天然产物的相关研究，寻找到天然产物合成中所需要的酶，并通过设计特异性引物，扩增获得其DNA全长片段，然后用相应的限制性内切酶对其进行酶切，再用DNA连接酶将其插入载体获得重组质粒。将获得的重组质粒转化到大肠杆菌中，并在对应的抗性平板上培养，利用各基因特异性引物进行菌落PCR，筛选验证后构建大肠杆菌工程菌。
　　姜黄素是从姜科、天南星科等植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，具有良好的抗炎和抗癌特性。在利用合成生物学方法合成姜黄素的研究中，研究者利用姜黄素生物合成关键酶β-酮酰辅酶A合酶基因和姜黄素合酶基因构建非天然融合基因，并将其与4-香豆酰辅酶A连接酶 和乙酰辅酶A羧化酶基因共同引入大肠杆菌中，构建合成姜黄素的大肠杆菌工程菌，进而实现姜黄素的大量生产。
　　CRISPR-Cas9基因编辑系统与核糖体工程
　　目前，在生物合成过程中，工程菌经过多轮的遗传改造和诱变育种会产生新的基因，以至于难以通过抗性基因对其进行遗传操作。而CRISPR-Cas9基因编辑技术不仅可以对靶向基因进行特定修饰，包括敲除、修复和替换等，同时还具有成本低、操作简便、效率高、功能多样等优点，因此近年来被广泛应用于合成生物学、代谢工程和医学研究等领域。
　　核糖体工程技术可对核糖体、RNA 聚合酶及转录因子进行修饰改造，进而提高次级代谢产物的生物合成。该方法常用靶向核糖体或RNA 聚合酶的抗生素来筛选抗性突变株。当得到的工程菌发酵水平无法达到工业水平时，可以通过核糖体工程技术来筛选出高产菌株，进而提高产量。
　　可利霉素是我国首次利用合成生物学技术研发的具有中国自主知识产权的一类新药。合成可利霉素的工程菌因多次基因改造已获得了两种抗性基因，难以再进行基因改造。然而CRISPR-Cas9基因编辑技术可以通过向导RNA指导Cas9蛋白对靶基因进行剪切，然后完成对DNA的编辑，之后再通过核糖体工程技术筛选得到可利霉素的高产工程菌株。
　　截至目前，利用合成生物学方法合成天然产物已取得了一定的成果。然而在生物合成的过程中，工程菌的重构随着基因簇的增大而变得愈发复杂，最后生成的产物也难以达到标准。因此，设计更好的基因编辑系统和构建更加适合的底盘细胞是未来发展的一个方向。
　　原始宿主的调控
　　对原始宿主的调控主要通过调控子（存在于基因旁侧序列中，能影响基因表达的序列），以及改变代谢途径中的加工酶或转运酶等来增加天然产物的产量。
　　研究者在有关糖多孢红霉菌TetR家族转录调控子SACE7301调控红霉素产量的研究中，通过敲除SACE7301基因构建了ΔSACE7301突变体。在之后的对比实验中发现，糖多孢红霉菌中TetR家族转录调控子SACE7301可正向增加红霉素的产量，但对糖多孢红霉菌的形态分化影响不大。研究者进一步通过凝胶阻滞实验发现SACE7301蛋白可在细菌体外与eryAI启动子结合，进而推测SACE7301可能直接调控红霉素的合成。
　　此外，在调控萜类合成途径的基因表达，进而提高β-胡萝卜素的产量时，研究人员将β-胡萝卜素合成途径基因导入大肠杆菌，并用多个调控元件对大肠杆菌甲基赤藓糖醇磷酸途径的7个基因和ispA基因进行调控。在此基础上，进一步对dxr、ispG和ispH基因进行调控，同时对dxs和idi基因进行组合调控，将β-胡萝卜素的产量提高了8倍。
　　基因表达的调控在天然产物合成方面获得了很大的突破。目前，原始宿主内的调控主要集中在正向调控元件或生物传感器的引入、负调控因子的删除或沉默，从而实现未知基因簇的激活和过表达。因此，建立可通用的生物传感器、发明快速准确的基因编辑手段是基于原始宿主调控天然产物合成产量的重要策略。
　　合成生物学对天然产物的实际生产将会产生颠覆式的影响。自合成生物学诞生至今的20多年来，其发展成果只是冰山一角，还有许多问题等待科研人员继续挖掘和研究。合成生物学在化合物生产、组织医疗、食物生产、甚至是宠物娱乐行业都有理论上的应用，这是一门前沿的、将科幻变为现实的、应用型交叉学科，同时它带来的相关社会伦理问题也需要进行深入讨论。
　　叶少杰，本科生；秦嘉豪，本科生；路斯博，本科生；魏岱旭，教授，博士生导师：西北大学生命科学与医学部，西安 710069，weidaixu@nwu.edu.cn
　　Ye Shaojie, Undergraduate; Qin Jiahao, Undergraduate; Lu Sibo, Undergraduate; Wei Daixu, Professor, Department of life sciences and medicine, Northwest University, Xi’an 710069, weidaixu@nwu.edu.cn.Zhao Q, Cui M Y, Levsh O, et al. Two CYP82D enzymes function as flavone hydroxylases in the biosynthesis of root-specific 4’-deoxyflavones in Scutellaria baicalensis. Molecular Plant, 2018, 11: 135-148. Sun J, Lin Y, Shen X, et al. Aerobic biosynthesis of hydrocinnamic acids in Escherichia coli with a strictly oxygen-sensitive enoate reductase. Metabolic Engineering, 2016, 35: 75-82. Tan D, Wu Q, Chen J, et al. Engineering Halomonas TD01 for the low-cost production of polyhydroxyalkanoates. Metabolic Engineering, 2014, 26: 34-47. Wei D X, Dao J W, Chen G Q. A micro-ark for cells: highly open porous polyhydroxyalkanoate microspheres as injectable scaffolds for tissue regeneration. Advanced Materials, 2018, 30(31): 1802273. Zhao X H, Peng X L, Gong H L, Wei D X. Osteogenic differentiation system based on biopolymer nanoparticles for stem cells in simulated microgravity. Biomedical Materials, 2021, 16(4): 044102. Tan G, Deng Z, Liu T. Recent advances in the elucidation of enzymatic function in natural product biosynthesis. F 1000 Research, 2015, 4: 1399. 崔金明，王力为，常志广. 合成生物学的医学应用研究进展, 2018, 11: 1000-3045. Zhang Y, Nielsen J, Liu Z. Engineering yeast metabolism for production of terpenoids for use as perfume ingredients, pharmaceuticals and biofuels. FEMS Yeast Research, 2017, 17(8): 80. Singh B, harma R A. Plant terpenes: defense responses, phylogenetic analysis, regulation and clinical applications. Biotechnology, 2015, 5(2): 129-151. Ukiya M, kihisa T, Yasukawa K, et al. Anti-inflammatory and anti-tumor-promoting effects of cucurbitane glycosides from the roots of Bryoniadioica. Journal of Natural Products, 2002, 65: 179-183. Martin V J, Pitera D J, Withers S T, et al. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nature Biotechnology, 2003, 21: 796-802. 章青. 浅析基因工程中工具酶的几个问题. 生物学通报, 2011, 7: 22-23. 王世珍, 刘凯泷, 王世燕, 等. 新型材料固定化氧化还原酶研究进展. 福州大学学报(自然科学版), 2021, 49(04): 568-576.
　　关键词：合成生物学 天然产物 工具酶 大肠杆菌  ■